负载her―2的树突状细胞诱导t细胞对骨肉瘤杀伤活性的研究

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1、负载HER-2的树突状细胞诱导T细胞对骨肉瘤杀伤活性的研究摘要：目的研究用HER-2抗原负载树突状细胞诱导T淋巴细胞对骨肉瘤细胞系U2-0S的杀伤活性。方法用HER-2抗原肽段E75369-377(HER-2组)、PBS(PBS组)分别负载PBMC来源的树突状细胞，与T淋巴细胞共培养7d后检测各组T细胞穿孔素的表达，通过LDH释放法比较两组T细胞对U2-0S的杀伤活性。结果HER-2组的T细胞表达穿孔素高于PBS组(P<0.01)；IIER-2组的T细胞对U2-OS的杀伤率高于PBS组(P<0.01)。结论用HER-2抗原肽E7536

2、9-377负载树突状细胞诱导T细胞能提高对骨肉瘤细胞系U2-0S的杀伤效率。关键词：树突状细胞；HER-2；骨肉瘤；免疫治疗负载肿瘤抗原的树突状细胞可以诱导T淋巴细胞对肿瘤细胞产生特异性杀伤免疫效应[1],据此我们用人类表皮生长因子受体2(HER-2)负载人树突状细胞诱导同源的T淋巴细胞，观察其对人骨肉瘤细胞系U2-0S的杀伤活性。1资料与方法1.1一般资料骨肉瘤细胞株U2-OS购自中国科学院上海细胞库;IIER2(E75369-377)肽段购自上海强耀生物科技有限公司；rhGM-CSF.IL-4和TNF-a购于PeproTech公司

3、；重组人白细胞介素-2(rhIL-2)购于北京双鹭药业股份有限公司；Anti-HumanHLA-DRAPC购于美国BD公司;PermeabilizationKit购于ADG公司;CytoTox96?非放射性细胞毒性检测试剂盒购于美国Promega公司。1.2方法1.2.1DC的分离、培养、及鉴定从健康成人屮筛选岀5名HLA-A2表型阳性的志愿者，抽取外周血10ml,用Ficoll密度梯度离心法［2］提取外周血单个核细胞(PBMC),细胞计数平均在5X107-7X107个；用贴壁法分离出单核细胞，悬浮的淋巴细胞冻存备用。单核细胞用含80

4、0U/mlGM-CSF和500U/mlIL-4的1640培养基培养，添加15%的无支原体胎牛血清(FBS),诱导其向树突状细胞(DC)分化。培养第5d时加TNF-a100ng/ml刺激DC成熟。培养至第7d收集细胞105个，用流式抗体APC-HLA-DR标记，同时设置阴性对照，在流式细胞仪上检测成熟DC表面分子标记。1.2.2用HER-2抗原负载DC收集成熟DC,取1X106个细胞，离心后用2ml含GM-CSF和1L-4的1640培养基重悬，细胞悬液等分为2份，转移到2支5mlEP管屮，分别加HER-2抗原肽E75369-377(2m

5、g/ml)20ul(HER-2组)、PBS20ul(PBS组)，摇匀后在37°C、5%C02培养箱中孵育4h,期间每30niiri摇匀一次。然后加PBS3ml离心,用淋巴细胞培养基2nd重悬。1.2.3诱导抗原特异性T细胞提前Id复苏同源的淋巴细胞，用1640培养基(添加15%的FBS)在37°C、5%C02培养箱屮培养一天，观察细胞状态。取IX107个淋巴细胞，按DC：T为1：10的比例分别与HER-2组和PBS组的DC悬液混合，同时加入细胞因子IL-2(500U/ml)o在37°C、5%C02培养箱中共培养7d诱导抗原特异性T细胞

6、，每2天补液lnil,并相应添加IL-2o1.2.4检测T细胞穿孔素的表达收集HER-2组和PBS组经DC诱导的T细胞，每组取106个细胞到流式分析管中，用PBS3ml洗一遍后加100"固定液，混匀后室温避光孵育15min；然后加3ml的PBS洗一遍，弃尽上清;然后加入100ul破膜剂，再加流式抗体Anti-PerforinPE5ul,混匀后避光室温孵育15min；加3mlPBS洗一遍，然后弃尽上清;用1OOulPBS重悬细胞，在流式细胞仪上检测T细胞穿孔素的表达。1.2.5乳酸脱氢酶(LDII)释放实验检测T细胞对骨肉瘤细胞的杀伤率

7、用CytoTox96R非放射性细胞毒性检测试剂盒，按照说明书操作。收集HER-2组和PBS组经诱导的T细胞作为效应细胞；取对数期牛长的U2-0S细胞，调整密度为1.0X105/ml；将T细胞与骨肉瘤细胞U2-0S按40：1、20：K10：1的比例分别加入96孔板屮，每组设3个复孔，同时设T细胞自然释放孔、U2-0S细胞自然释放孔、U2-0S细胞最大释放孔，在37°C、5%C02培养箱里共孵育6h,酶标仪测定波长490nm的吸光度。按以下公式计算杀伤率，杀伤率(%)=(E-S1-S2)/(M-Sl)X100%,其中E二实验孔0D均值，S

8、1二U2-0S细胞自然释放孔0D均值，S2二T细胞自然释放孔0D均值，M二U2-0S细胞最大释放孔0D均值。1.2.6统计处理用SPSS16.0软件分析，结果以(x土s)表示，采用t检验，检验水准，P<0.05为差异有统