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《树突状细胞-肿瘤细胞融合诱导抗肺癌ctl作用初步究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、树突状细胞/肿瘤细胞融合诱导抗肺癌CTL作用初步究【摘要】目的探讨人源树突状细胞/肿瘤细胞融合诱导的抗肺癌CTL作用。方法培养体系中加入rhGMCSFrhIL4rhTNFα等细胞因子诱导人骨髓来源树突状细胞,并与原代培养的人肺癌细胞融合;以融合细胞诱导外周血产生CTL并测定其细胞毒性。结果骨髓单个核细胞在rhGMCSFrhIL4rhTNFα等细胞因子存在下培养10～12d,出现典型的成熟树突状细胞。体外诱导的人骨髓来源树突状细胞(DC)表达较高水平HLADR、CD86。对照DC和肿瘤细胞表达相应检测的单种抗原,而融合细胞两种抗原的表达水平均较高。DC/肺癌
2、细胞融合在体外能有效诱导CTL产生,后者对靶细胞产生较强的细胞毒作用。结论通过本课题的研究证实DC与肿瘤细胞融合技术制备的肿瘤疫苗代表一类更为有效的抗肿瘤免疫策略。【关键词】树突状细胞;细胞融合;肺癌;疫苗7树突状细胞(DC)是目前鉴定的最有效的抗原递呈细胞(APC),自1973年首次识别DC以来,对DC的研究不断深入。DC独特的形态、高表达抗原递呈分子及介导T细胞连接、共刺激的辅助分子等生物学特性决定其在免疫学中的重要作用[1]。人类肿瘤表达大量能被T细胞识别的蛋白质抗原,为癌症免疫治疗提供靶位,但大多数人类肿瘤为弱免疫源性,能逃避宿主免疫系统。抗原递呈
3、途径的改变为肿瘤特异性抗原不能向宿主递呈的原因之一。为此改变、促进机体免疫系统对肿瘤抗原的递呈是肿瘤免疫治疗中具有实用价值的研究方向。鉴于DC在抗原递呈中的重要作用,以其为基础设计的肿瘤疫苗日益受到重视。本研究在诱导人骨髓来源树突状细胞的基础上,探讨了树突状细胞/肿瘤细胞融合特异性抗肺癌免疫研究。1材料和方法1.1骨髓共6例,取自中日联谊医院胸外科肺癌患者手术中切下的肋骨,骨髓病理检查证实均无癌骨髓转移灶,为正常骨髓象。肺癌标本:共6例,取自上述患者手术标本,均经病理检查确诊。外周血:上述6例患者外周血。1.2主要试剂IMEM培养基、胎牛血清、FITC标记
4、抗CD86、HLADRMcAb、PE标记抗CA199McAb、淋巴细胞分离液、rhGMCSF、rhIL4、rhTNFα、PEG4000、3HTdR等。1.3人骨髓树突状细胞的诱导及鉴定体外诱导:无菌取手术患者术中切下的肋骨,除去上面附着的软组织,用PBS冲洗,再用骨钳切为约3～47cm长,从一端插入事先吸入培养液的注射器,冲洗骨髓腔,冲洗数次,用200目铜网过滤,淋巴细胞分离液(70%)分离单个核细胞,PBS洗两次,用15%DMEM配制成2×10�5/ml单细胞悬液,培养于37°,培养体系中加入人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)和白介素4
5、(rhIL4)诱导骨髓单个核细胞在体外产生树突状细胞。1.4DC表型分析收集培养10d的DC与抗体CD86、HLADR作免疫荧光染色及FACS分析。1.5人肺癌细胞的原代培养选取6例中日联谊医院住院手术肺癌患者的手术标本,均经病理确诊。无菌取下肿瘤组织后,机械剪碎,用0.25%胰蛋白酶消化后5h,收集单个细胞,DMEM洗2次,培养于15%DMEM中;经组织学染色观察肿瘤细胞形态学特征。1.6人骨髓DC与人肺癌细胞融合及鉴定用50%聚乙二醇(PEC)4000融合DC与原代培养的肺癌细胞,DC与肿瘤细胞的比例为6:1,PBS洗涤后,融合细胞培养在含15%FCS
6、的DMEM培养液中,培养体系中含GMCSF(4ng/ml)。通过以FICT抗HLADR、CD86抗体标记DC,测定HLADR、CD86表达水平。选取一株CA199阳性表达的细胞DC/肿瘤细胞融合细胞,以PE抗CA199和FICT抗CD86进行双标记,同时以DC和肿瘤细胞作对照,检测DC与肿瘤细胞的融合效力。1.7CTL的产生及细胞毒性的测定以20,000rad剂量照射DC单独(1.7×10�6/鼠)、肿瘤细胞单独(B16或3LL)(3×10�75/鼠)、DC单独、DC与肿瘤细胞同时加入、抗原肽刺激DC、DC/肿瘤细胞融合瘤苗后,上述细胞再与同源PBMC共同
7、培养3d,而后与原代培养细胞共同培养5d,掺入3HTdR18h后,收集细胞,测定放射性核素闪烁记数值。2实验结果2.1树突状细胞的诱导在培养的前7d,无明显细胞集聚体出现,加入GMCSF、TNFα继续培养3～5d,出现典型的成熟树突状细胞,见图1。图1人骨髓来源的树突状细胞的形态学观察(200×)2.2肺癌细胞的原代培养如图2所示,6例原代培养肺癌细胞均呈上皮型,细胞形态多样,多呈多角型,核:浆比例增加,核深染。图2原代培养肺癌细胞(瑞氏染色)2.3人骨髓DC/肺癌细胞融合诱导的CTL的细胞毒性见表1。结果表明DC/肺癌细胞融合在体外能有效诱导CTL产生,
8、后者对靶细胞产生较强的细胞毒作用;以抗原肽刺激DC或DC/肺癌细胞
