神经母细胞瘤中trks基因的表达与k252a对神经母细胞瘤细胞的作用

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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意．申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任．论文作者签名：盔莲日期：丝堕：￡芝中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国

2、医科大学．本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅．学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：塑逢指导教师签名：犀丛幻神经母细胞瘤中Trk8基因的表达及勉52a对神经母细胞瘤细胞的作用前、盲神经母细胞瘤(Neuroblastoma，NB)是儿童最常见的肿瘤之一，它起源于神经蜷的交感神经链。患者病情预后评判部分取决予就诊时患者的年龄及其肿瘤分期。

3、NB肿瘤富有兴趣的一个特征是某些婴儿播散性胂瘤能够在未经治疗的情况下自行消退。多数研究表明某些肿瘤标记物可能和NB肿瘤的分期及其预后相关。目前认为Trks原癌基因的表达在调节NB肿瘤的生物学特征方面具有重要性作用。同源性神经营养素(NeⅢotmphins，NTs)家族包括神经营养因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(N’r．3)及神经营养素．4／5(N隧／5)。人们近来已经克隆出来三种酪氨酸激酶受体(Ty舶sineki-naserc叩tors，Trks)基因，即TrkA、TrkB及TrkC基因各自分别编码NGF、BDNF及NT-3的对应性

4、受体。NTs通过粘附和激活跨膜Trks受体激酶而发挥调节缨胞的作用。因此Trks受体激酶在调节正常和肿瘤神经细胞的存活、生长及分化中具有楣当重要的作角。7氏ks激酶抑铡裁作秀NB髀癯治疗的探索正是基于此种假说，即NB肿瘤的细胞生长是通过NT／Trk信号转导通路来维持肿瘤细胞的存活和增殖。为了评估NB肿瘤中Trks基因表达的状况及其意义，我们分别采用免疫组化和逆转录．聚合酶链反应技术，对NB肿瘤组织中这些受体激酶的表达水平进行半定量检测和评价，旨在探讨这些Trks基因表达和NB肿瘤的分化成熟、肿瘤分期及预后评估的关系。我们认为普通医院的临床实验室比较容易采纳这些方法

5、以便开展对NB患者进行分子和遗传学的评价。此外，我们还研究了K252a在体外对神经母细胞瘤sY5Y细胞的形态和生长的影响，并对其作用杌理进行了初步性探讨，为开展也52a类衍生物在NB移植模型中的抗肿瘤研究奠定了良好的工作基础。方法一、临床部分1、临床资料：本组资料来源于我院自1997年至2003年已经治疗的40例患者的肿瘤组织，其中神经母细胞瘤(NB)34例、神经节神经母细胞瘤(GNB)2例及神经节细胞瘤(GN)4例。全部肿瘤患者均经术后病理所证实。患者确诊年龄为2月一14岁，平均年龄为3．2岁。根据Evans标准进行NB的肿瘤分期，其中I期5例、Ⅱ期6例、Ⅳs期

6、3例、Ⅲ期7例及Ⅳ期13例。2、免疫组化：采用链霉亲和素一生物素复合物(sABC)免疫组化染色技术对40例NB肿瘤组织中Trks受体激酶的表达进行检测。本组全部肿瘤组织统一进行Trks受体免疫组化染色的半定量分级。采用0—5的六级评定分类法：O级为组织没有染色；1级为组织微量染色；2级为偶见细胞染色；3级为细胞少量染色；4级为细胞大量染色；5级为细胞极强染色。每个切片中随机选取10个区域，高倍镜下观察和评级，随后计算这10个高倍视野区的平均分级值。3、RT．PcR：采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)技术对27例NB组织中Trks基因mRNA的表达进行半定量检测

7、。本组全部NB组织中Trks基因的表达，通过密度分析法测定各种靶基因产物与内参照基因产物B—actin的比值，半定量分析这些靶基因的相对表达水平。我jf丁根据其比值差异的范围而采用三级分类法：<0．5为不表达，O．5—1．o为低表达，>1．0为高表达。二、基础部分l、细胞培养：人类神经母细胞瘤SY5Y细胞株经过复苏处理后，放置于RPMI一1640培养基中，在37℃含有5％C0：的饱和湿度条件下培养以维持细胞生长。2、细胞转染：采用脂质体Lipofectamine介导转染技术对SY5Y细胞株进行转染。将本组转染pBPSTRl-TrkA和pBPS，rRl质粒的细胞，分

8、别命名为S