mir-31调控靶基因satb2改变肺癌细胞功能的实验研究

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1、硕士学位论文论文题目miR-31调控靶基因SATB2改变肺癌细胞功能的实验研究研究生姓名陈旭指导教师姓名顾国浩专业名称临床检验诊断研究方向分子生物学论文提交日期2013年4月miR-31调控靶基因SATB2改变肺癌细胞功能的实验研究中文摘要miR-31调控靶基因SATB2改变肺癌细胞功能的实验研究中文摘要目的筛选出转移性肺癌患者血清中异常表达的miRNAs，测定其在肺癌细胞系中的表达情况，并验证其作用靶点。探讨miR-31调控靶基因SATB2改变肺癌细胞迁移和侵袭能力的作用机制。方法第一部分建立基于实时荧光定量PCR检测肺癌患者血清miRNAs的方法

2、，用该法检测61例肺癌患者血清（其中26例有远处转移）中9种miRNAs（miR-20a、miR-21、miR-25、miR-29a、miR-31、miR-126、miR-129、miR-145、miR-205）的表达情况。第二部分应用生物信息学预测软件TargetScan、mirBase和PicTar对miR-31靶基因进行预测,选定靶基因SATB2的3'UTR区克隆到PGL3-control荧光素酶报告基因载体下游,通过双荧光素酶报告基因检测miR-31对靶基因SATB2的3'UTR区的调控能力。将miR-31mimics/inhibitors瞬

3、时转染人肺腺癌细胞95D（人高转移肺腺癌细胞），通过Westernblot检测miR-31对SATB2蛋白表达的影响。第三部分应用Real-timePCR对肺支气管上皮细胞（HBE）及肺腺癌细胞株（A549、H1299、95C和95D）内的miR-31作定量检测。通过Westernblot检测人肺癌细胞系中SATB2的表达，选择SATB2蛋白表达最高的肺腺癌细胞株（95D）。建立过表达或抑制miR-31的人肺腺癌95D细胞系，同时建立抑制SATB2的人肺腺癌95D细胞系，应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖的变化，利用单层伤口愈合实验和transwell

4、小室检测肺腺癌95D细胞迁移和侵袭能力的改变。结果第一部分实时荧光定量PCR检测出miR-31结果提示:在肺癌血清标本中当有远处转移时其表达水平显著降低（t=3.320，P=0.002），其表达差异具有统计学意义。第二部分成功构建SATB2的3'UTR区表达载体PGL3-SATB2。双荧光素酶报告I中文摘要miR-31调控靶基因SATB2改变肺癌细胞功能的实验研究基因分析表明miR-31能够作用于SATB2的3'UTR。通过Westernblot，与对照组相比，转染miR-31mimics组的SATB2的蛋白表达降低，而转染miR-31inhibit

5、ors组的SATB2的蛋白表达升高，进一步证实SATB2是miR-31的靶基因。第三部分以人肺支气管上皮细胞HBE作为对照，在四种肺腺癌细胞株A549、H1299、95C和95D中，miR-31的表达水平在95D（人高转移肺腺癌细胞）细胞系中是最低的（F=6.976,P=0.001），其表达差异具有统计学意义。Westernblot结果表明SATB2在高转移潜能的人肺腺癌细胞株95D中表达最高。miR-31与SATB2的表达呈负相关。在人肺腺癌细胞95D中过表达miR-31及抑制SATB2后降低细胞的迁移和侵袭能力，而抑制miR-31的表达则会增强细

6、胞的迁移和侵袭能力。但在95D细胞中改变miR-31的表达对细胞增殖作用不大。结论初步筛选与转移性肺癌相关的miRNAs。miR-31可能是转移性肺癌的标记性miRNAs之一。SATB2是其作用靶点，miR-31作用于SATB2的3'UTR可在转录后水平上调控SATB2蛋白的表达。miR-31在高转移能力的人肺腺癌细胞95D中呈低表达,具有类似抑癌基因的作用调控SATB2的表达,降低了人肺腺癌细胞95D的迁移和侵袭能力，SATB2是miR-31的靶基因，有望成为肿瘤生物治疗的一个靶点。关键词：microRNA；肺癌；miR-31；SATB2；迁移；侵

7、袭作者：陈旭指导教师：顾国浩IIMiR-31regulatesthefunctionoflungcancercellsbytargetingSATB2AbstractMiR-31regulatesthefunctionoflungcancercellsbytargetingSATB2AbstractObjectiveToscreenabnormalexpressionofmiRNAsintheserumoflungcancerpatientswithmetastasis,thentestingitsexpressioninlungcancercell

8、linesandtoverifyitstarget.ToinvestigatetheeffectsofmiR