家蚕滞育关联miRNA及其靶基因调控关系研究.pdf

《家蚕滞育关联miRNA及其靶基因调控关系研究.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、学校代码：10564学号：2013202601分类号：S881.2密级：硕士学位论文家蚕滞育关联miRNA及其靶基因调控关系研究范文涛指导教师：林健荣教授学院名称：动物科学学院专业名称：特种经济动物饲养答辩委员会主席：邱宝利教授中国·广州2016年6月I华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完

2、全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：学科带头人签名：日期：摘要本文以家蚕932蚕卵为材料，采用生物信息学、PCR、qRT-PCR、DLR与ELISA等方法，通过筛查与家蚕滞育密切相关的miRNA及其靶基因，分析其在滞育卵、即时浸酸卵、赤豆色浸酸卵的表达差异及调控作用，以进一步探索家蚕滞育发生与滞育解除的分子调控机理，取得主要结果如下：（1）利用生物信息学工具RNAhybrid等对蚕

3、卵经浸酸后发生显著上调或下调的miRNA各4个进行分析，从中筛选出2个与家蚕滞育密切关联的bmo-miR-3384-3p与bmo-miR-2761-3p，并进行靶标预测，得知bmo-miR-3384-3p在候选靶基因BmNLK的3’UTR的11-64位碱基存在结合位点，而bmo-miR-2761-3p与BmSDH基因结合位点在其3’UTR的396-423位碱基。（2）通过PCR扩增技术，比较候选靶基因BmNLK、BmSDH在家蚕滞育性卵、赤豆色浸酸卵中的转录表达情况，经检测分析，当蚕卵经盐酸浸渍处理后，BmSDH基因和

4、BmNLK基因发生显著上调现象，而在非浸酸卵中则处于低水平的表达状态，表明两基因在滞育性卵与浸酸卵中有明显的差异表达。（3）用qRT-PCR技术对滞育性卵与赤豆色浸酸卵在卵龄3-7d时bmo-miR-2761-3p、bmo-miR-3384-3p、BmSDH基因和BmNLK基因的表达水平进行定量分析，结果在浸酸卵中，bmo-miR-3384-3p、bmo-miR-2761-3p的相对表达量最低时分别比浸酸前下降了76%和78%，而BmNLK基因和BmSDH基因的相对表达量最高时则分别上调了217%和4287%。经统计分

5、析，bmo-miR-2761-3p与BmSDH基因、bmo-miR-3384-3p22与BmNLK基因的表达关系呈负相关性（R1=0.94，R2=0.92）。由此表明，蚕卵处在滞育状态时，BmSDH基因、BmNLK基因低水平表达，当蚕卵浸酸后则显著上调。（4）为验证bmo-miR-2761-3与BmSDH基因、bmo-miR-3384-3p与BmNLK基因的靶标关系，分别构建了含有BmSDH3’UTR、BmNLK3’UTR的载体，并经DLR法检测验证，证实了bmo-miR-2761-3p会抑制BmSDH基因的表达；bm

6、o-miR-3384-3p会抑制BmNLK基因的表达。（5）借助ELISA方法测定了即时浸酸卵和赤豆色浸酸卵浸酸后至孵化前1d、滞育性卵于5℃冷藏0、10、20、30、40、60、80d期间的BmSDH酶和BmNLK酶的活性，结果蚕卵一经浸酸，酶活快速上调，即时浸酸卵、赤豆色浸酸卵在浸酸后经过I2dBmNLK酶的活性就到达峰值，分别为2972.24mU/g、2800.45mU/g，比对照分别提高了13.26倍和12.43倍。BmSDH酶则于浸酸后经过3d时出现峰值，即时浸酸卵的为1003.36mIU/g，赤豆色浸酸卵的

7、为662.29mIU/g，比对照分别提高了4.50倍和2.63倍。滞育卵在5℃冷库中冷藏时，入库初期酶活活性下降，当冷藏经过30d/20d时，酶活开始上调，到80d时，BmNLK酶和BmSDH酶活性到达最大值。由此表明，BmNLK酶和BmSDH酶的活性变化，与蚕卵的滞育解除存在联动关系。关键词：家蚕卵；滞育；miRNA；靶基因；调控关系IIStudiesonDiapause-relatedmiRNAsanditstargetGeneRegulationinDiapauseSilkworm,BombyxmoriFanWe

8、ntao（CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China）Abstract：932strainofsilkwormwasusedasresearchmaterialinthepaper.Tofurtherexplorethe