miRNA靶基因实验验证的研究进展.pdf

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1、重庆医学2009年1月第38卷第2期21l·综述·miRNA靶基因实验验证的研究进展曹学武综述，陈正堂△审校(第三军医大学新桥医院全军肿瘤研究所，重庆400037)关键词：miRNA；生物信息学；mRNA；共表达；3，一UTR；结合位点中图分类号：Q786文献标识码：A文章编号：1671—8348(2009)02—0211一O3miRNAs是一大类非蛋白编码的小分子RNA，他们已成算方法中的2种计算方法均预测到的miRNA结合位点，有必为基因表达的重要调节因子l】。]。目前已有约500个mRNAs要进

2、一步用实验验证。被分离并鉴定j。然而，Et前有研究报道人类基因组中含有约1．2miRNA可接近性分析因为很多经种子序列匹配预测1000个miRNAs[]。miRNAs通过使其靶mRNAs的翻译的miRNA靶经体内验证实验证实并不是真的miRNA靶，为抑制或降解来抑制基因表达l7。每个miRNA都有数百个进了起始一步减少预测到的抑制一给定的靶mRNA表达的化上保守的靶基因，以及几倍的非保守的靶基因。目前估计人miRNA的数量，进一步的程序分析是有必要的。结构特征控类3O的基因可能被miRNAs调控ll。

3、制着miRNA／mRNA问的相互作用的观点已被越来越多的人miRNA靶基因的鉴定已成为一个巨大的挑战。在miR—所接受。例如，一个RNA分子的大部分结构是高度复杂性NA靶基因预测方面，生物信息学的计算方法已成为最主要的的，只有特定的单链区域允许miRNAs接近并与互补位点结推动力“。。这些计算方法主要利用程序来鉴定和校正miR—合。因此，复杂的RNA二级结构可能阻止miRNA／mRNA的NA的3r_UTR内与miRNA的种子序列互补的位点，以及这相互作用。最近Zhao等[】’的研究证实，绝大部分已证实

4、的些同源基因3UTR内互补序列在种系发生学上的保守性。靶的一个共同特征是优先与基于热动力学在RNA分子中容然而，有证据显示，完全种子序列的配对不一定是一个可靠的易接近且没有复杂二级结构的3UTR区中的位点。由于miRNA相互作用的指标[1，这可解释为什么一些预测的靶位RNA可接近性可能是靶识别的一个关键特征，所以有必要采点不具功能性。因此，除极少个例外，绝大部分生理学及临床用Zhao等的方法，采用inFold软件测定预测到的miRNA结相关的miRNA的靶基因需要通过实验进行鉴定或验证。合位点5端和3

5、端各7O个核苷酸的自由能(AG)，当△G低目前对于应遵循什么标准来确定miRNA的靶基因及证于平均随机自由能时提示此位点允许miRNA接近并结合2o_。实其生物学效能没有明确的一致意见。因此本综述的目的是这些允许miRNA接近并结合起来的位点，有必要进一步用实探讨一套指导原则，以便研究者可参考这套原则来验证一个给验进行验证。定的miRNA是否调控一个特异的靶mRNA。同时本综述也2miRNA／mRNA间相互作用的结构学验证探讨一些可以用来验证miRNA靶mRNA的实验程序。基于2．1荧光素酶报告载体系

6、统一旦生物信息学方法预测到结Martin等’”的实验研究，为了减少生物信息学预测到的合位点及该位点具有可接近性，miRNA／mRNA间相互作用miRNA结合位点，加速感兴趣的靶位点的生物学验证，可建立的功能重要性可以被验证。由于计算方法可能在一个特异靶一套工作流程图。在完成生物信息学的预测后，可分别进行mRNA上预测到大量的miRNA结合位点，因此，有必要用一miRNA／mRNA相互作用的功能学验证和结构学验证。种快速且可重复的分析来迅速消除不具功能性的相互作用位1常用的生物信息学预测方法点。因此，可

7、采用一种报告基因系统来实现这一目的。使用这1．1miRNA靶的生物信息学预测当开始研究一基因是否种分析研究的判定标准是一给定miRNA与其特异mRNA靶为一个miRNA调控的靶基因时，可以用不同的生物信息学计位点结合后将抑制报告基因蛋白的生成，因此与对照相比，报算方法来分析每个序列(如mRNA的3rUTR区序列)，这些告基因蛋白表达／活性的减低可以被检测到。实验方法是将感计算方法采用不同的参数来预测一个给定的靶mRNA内具功兴趣的靶基因的3LUTR区克隆到报告质粒载体荧光素酶或能性miRNA结合位点的

8、可能性。由于每种计算方法的有效绿色荧光蛋白开放阅读框序列的下游。必须强调的是，克隆序性不同，下面3种计算方法应该被用来预测miRNA结合位列必须是全长的3r_UTR区，因为此序列的截断到位可能改变点：miRanda、TargetScan和PicTar。这3种计算方法都允许预测靶位点的miRNA接近性。研究者输入一个基因符号，这些计算方法将计算此基因内所有2．2pulldown策略尽管miRNAs抑制嵌合体报告基因翻预测的miRNA结合位点。此外，这些计算