miRNA 靶基因识别和功能调节.ppt

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1、miRNA靶基因识别和功能调节一、mRNA简介microRNA（miRNA）是一类能够调节基因表达的短单链內源非编码RNA（约22nt），通过与互补的mRNA选择性地结合抑制蛋白的产生，广泛存在于动物、植物、病毒等多种有机体中。 miRNA通常位于基因间或者内含子区域，在细胞核内有RNA聚合酶Ⅱ转录产生具有帽子结构多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA。在核酸酶Drosha及其辅助因子Pasha的作用下，pri-miRNA被处理成70个核苷酸组成具有茎环结构的pre-miRNA，然后由Exportin 5等转运至细胞质。Dicer将pre-miRNA切割成约22nt的双链miRNA。双链miRNA

2、讲解形成单链的成熟miRNA。成熟miRNA还需要与Argonaute蛋白等组装形成RNA诱导沉默复合体（RISC），RISC作用于特异mRNA的3’UTR，从而抑制翻译过程或者直接降解mRNA。SiRNA与mRNA比较SiRNA和mRNA也有区别。1.根本区别是miRNA是内源的，在基因组中有固定的基因座位；siRNA可以是人工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片断和转座片断，病毒基因组转录片断等，关键在于siRNA没有固定的基因座位，本身不是基因组的功能片断，是随机产生的，即加工位点不是保守的。2.二者结构上没有本质区别，功能分子都是单链RNA，miRNA转录出来时必然是发夹状的，

3、siRNA可以由完全互补的双链切断而来，也可以从发夹来。二、靶基因预测方法尽管对miRNA功能的认识还不是非常清楚，但miRNA在许多生物过程中起关键作用，包括发育、细胞分化、增殖、凋亡、肿瘤转移等。准确快速地预测miRNA靶基因对于研miRNA功能以及分析miRNA参与的生物学过程具有十分重要的意义。目前寻找miRNA靶基因的方法主要有生物信息学以及生物实验方法。1、生物信息学方法生物信息学方法主要是利用某种算法对靶基因样本进行评分及筛选。生物信息学的方法只是通过算法为研究人员提供可能性最大的参考信息，还需要通过实验进行验证。目前常规的算法主要遵循以下几个常用原则：（a）miRNA与靶基因的

4、互补性；（b）miRNA靶位点在不同物种之间的保守性；（c）miRNA-mRNA双链之间的热稳定性；（d）miRNA靶位点不会有复杂的二级结构；（e）miRNA 5’端于靶基因的结合能力强于3’端。除了这些基本原则以外，不同的预测方法还会根据各自总结的规律对算法进行限制和优化。使用计算机预测植物miRNA靶基因比较简单，因为在植物中miRNA与靶基因几乎还是以完全互补配对的方式结合，预测不需要复杂的算法。而预测动物miRNA靶基因则存在一定的困难，主要是目前已知的miRNA靶基因及其确切靶点不多，在算法编写时没有足够的已知样本可供参考。但是，miRNA与靶基因间的相互作用仍然具有一定的规律性。

5、各不同算法各有其特点，主要还是依据miRNA与其靶位点的互补性、miRNA靶位点的保守性、miRNA-‐mRNA双链之间的热稳定性及附近序列的二级结构等原则设计的。其中，miRanda是将miRNA-‐mRNA之间的序列匹配，保守性及热稳定性作为计算参数，有比较好的检出率，但是假阳性率也较高；TargetScan提出了“种子区”的概念，增加了预测的精确度。2、生物学实验方法(1) 从mRNA水平寻找miRNA靶基因将miRNA成熟体双链或腺病毒载体转染至细胞中，使得miRNA在细胞中过表达，之后利用基因芯片分析mRNA的变化以找出相应miRNA的靶基因[9]。由于miRNA在体内通过翻译抑制或

6、影响mRNA的稳定性起作用，因此这种方法在寻找起翻译抑制作用的miRNA的靶基因时存在一定困难。（2）从蛋白质水平寻找miRNA靶基因由于miRNA所介导的转录后翻译抑制过程不引起mRNA水平的改变，因此依据mRNA水平的变化寻找miRNA靶基因的方法在检出率上存在一定问题。Selbach[13]和Baek[14]两个研究组分别利用蛋白质组学的研究方法，建立了从蛋白质水平寻找miRNA靶基因的新方法。此外，目前最为常用的miRNA靶位点鉴定方法是荧光素酶报告基因法。其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体，将希望鉴定的miRNA靶基因的3’UTR构建到荧光素酶基因的3’UTR中；之后将构建好的载体

7、转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平；最后检测荧光素酶的表达情况，以分析转染3’UTR中是否含有miRNA的靶位点[1,15]。三、功能调控与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达（哺乳动物中比较普遍）。然而有证据表明，这些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。使用这种机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3’端非编码区。如果miRNA与靶位点完全互补（或者几乎完