绵羊骨骼肌高表达mirna靶基因的高通量获取及部分候选靶基因生物功能研究

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1、ResearchonAcquiringTargetGenesofMiRNAExpressedataHighLevelinSheepSkeletalMusclebyaHighThroughputWayandFunctionofPartialTargetADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofAgricultureByZhangWei(AnimalGenetics,BreedingandReproductio

2、n)DissertationSupervisor:Pro.ShiGuoqingPro.GanShangquanSeptember,2015摘要为了掌握绵羊骨骼肌中miRNA的表达情况，深入探索其在绵羊骨骼肌发育过程中的表达特点及靶向调控的基因，进一步阐明miRNA对绵羊骨骼肌发育的调控机制，为优质肉羊品种的培育提供理论基础及新的育种手段。本研究首先以萨福克羊骨骼肌为材料，使用芯片技术对其骨骼肌中miRNA的表达情况进行了检测，并以此为基础对绵羊骨骼肌中高表达miRNA从以下4个方面开展了深入研究：首先，使用PCR-SSCP（Polymerasech

3、ainreaction-singlestrandconformationpolymorphism）技术对绵羊骨骼肌中高表达miRNA前体序列在4个不同产肉性能绵羊品种中的突变进行检测，寻找在不同产肉性能绵羊品种间差异较大的突变，分析相关突变与绵羊产肉性能之间的关系。选择7个对miRNA前体序列二级结构能值影响不同的突变，构建真核表达载体，通过真核细胞表达试验及qRT-PCR检测其对miRNA加工成熟的影响；其次，使用qRT-PCR技术检测绵羊骨骼肌中高表达miRNA在绵羊胚胎期第40d、60d、80d、100d、120d以及初生、6月龄和周岁绵羊骨

4、骼肌组织中的表达变化，并分析其与绵羊骨骼肌发育之间的关系；第三，使用本实验室开发的建库技术，构建绵羊胚胎期第60d和成年羊骨骼肌中高表达miRNA的靶基因文库；第四，以绵羊骨骼肌卫星细胞为材料，采用qRT-PCR和WesternBlot技术研究miR-133过表达和抑制表达对绵羊骨骼肌卫星细胞生长以及miR-133的4个候选靶基因表达的影响，分析miR-133对绵羊骨骼肌卫星细胞生长的调控作用。通过以上试验，本研究得到了以下结果：1.利用芯片技术在绵羊骨骼肌中共检测到261个miRNA，其中58个为已报道的绵羊miRNA，其余203个在绵羊中尚未见

5、报道；且这261个miRNA在同时期绵羊骨骼肌中的表达量不尽相同，其中有22个高表达的miRNA，其表达量占检测到miRNA总表达量的89%；2.首次在16个miRNA前体序列中检测到共计49个突变，其中包括41个单碱基突变和8个插入/缺失突变，另有6个miRNA前体序列没有检测到突变；对其中的3个突变在5个产肉性能不同的绵羊品种共计640份基因组样品中进行了进一步研究，发现miR-133a前体序列的CCC插入/缺失突变与绵羊的产肉性状高度相关；89.8%的突变对miRNA前体二级结构和成熟加工有影响，且突变对二级结构能值影响越大，突变位置离miR

6、NA成熟序列越近，对miRNA的成熟加工影响亦越大；3.绵羊骨骼肌中22个高表达miRNA在绵羊骨骼肌发育的不同时期表达量会出现上调或者下调，其表达量按照4种基本的模式发生变化。胚胎期大部分miRNA出现了两个低表达期，分别是胚胎期的40d至60d和120d；4.分别成功构建了绵羊胚胎期和成年期骨骼肌高表达miRNA靶基因文库。胚胎期I文库和成年期文库分别测序250个单克隆，得到246条和239条有效序列，阳性克隆率分别达到85%和79%。分别有132条和124条ESTs序列与NCBI中unigene序列匹配，占靶基因文库的53.66%和51.88

7、%；5.miR-133过表达对绵羊骨骼肌卫星细胞的增殖具有抑制作用；miR-133在绵羊骨骼肌卫星细胞中可靶向调控Rhoa，CDC42，TAGLN2基因的表达，造成其蛋白表达量极显著下调，但是对MSN基因没有调控作用。miR-133在Rhoa和TAGLN2的CDS区分别有一个靶位点，其余靶位点均位于3’UTR区。通过上述研究，对绵羊骨骼肌中miRNA的表达情况及其靶基因有了较为全面的认识，对骨骼肌不同发育阶段miRNA的表达变化情况及其功能有了更为深入的掌握。以上研究工作将为进一步阐明绵羊骨骼肌发育的分子调控机制奠定基础，为优质肉羊品种的培育提供坚

8、实的理论基础及新的育种手段，将对肉羊育种工作产生积极地推动作用。关键词：绵羊；骨骼肌；miRNA；靶基因IIAbstrac