粘毛黄芩毛状根外源基因表达系统的建立.doc

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1、粘毛黄芩毛状根外源基因表达系统的建立　　摘要：用携带植物高效表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋和发根型质粒ｐＲｉＡ４，“解除武装”的重组Ｃ５８Ｃ１工程菌感染粘毛黄芩无菌苗的幼茎、子叶、叶片，诱导毛状根的表达，以建立基于粘毛黄芩毛状根的高效外源基因表达系统。幼茎毛状根诱导率最高，达８８．９％。ＰＣＲ扩增检测粘毛黄芩毛状根单克隆基因组中的ｒｏｌＣ和ｈｙｇｒ基因片段，结果表明，ｐＲｉＡ４和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋均能整合到粘毛黄芩毛状根的基因组内，共转化率达２８．１％。　　关键词：粘毛黄芩；毛状根；共转化　　中图分类号：Ｓ５６７．２３＋９文献标识码：

2、Ａ文章编号：0439－８11419－4070-03　　　　ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆＥｘｏｇｅｎｏｕｓＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍbａｓｅｄｏｎＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｖｉｓｃｉｄｕｌａＨａｉｒｙＲｏｏｔｓ　　　　ＷＡＮＧＳｈｕ－ｆａｎｇ１，ＬＩＦｅｎｇ－ｈｕａ１，ＳＵＮＭｉｎ２　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｄｉｓａｒｍｅｄＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓｓｔｒａｉｎＣ５８Ｃ１ｈａｒｂｏｒｉｎｇｐｌａｓｍｉｄｐＲｉＡ４ａｎｄｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｖｅｃｔｏｒｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋ｗａｓｕｓｅｄｔｏ

3、ｉｎｆｅｃｔｔｈｅｙｏｕｎｇｓｔｅｍ，ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓａｎｄｌｅａｖｅｓｏｆＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｖｉｓｃｉｄｕｌａＢｕｎｇｅ．ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｅｘｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｉｎｄｕｃｉｎｇｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｈａｉｒｙｒｏｏｔｓｆｒｏｍｓｔｅｍｓｅｘｐｌａｎｔｓｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔ，ｗｈｉｃｈｒｅａｃｈｅｄｕｐｔｏ８８．９％．ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｗｏｐｌａｓｍｉｄｓｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆrｏｌＣａ

4、ｎｄhｙｇｒｇｅｎｅｓｆｒｏｍｔｈｅｈａｉｒｙｒｏｏｔｓｏｆＳ．ｖｉｓｃｉｄｕｌａ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂｏｔｈｔｈｅｔｗｏｇｅｎｅｓｃｏｕｌｄｂｅｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｈａｉｒｙｒｏｏｔｓｏｆＳ．ｖｉｓｃｉｄｕｌａ，ｗｉｔｈａｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ２８．１％．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｖｉｓｃｉｄｕｌａＢｕｎｇｅ.；ｈａｉｒｙｒｏｏｔｓ；ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　　　　粘毛黄芩是唇形科黄芩属多年生草本植物［１，２］，其药用成分主要分布于根部。药理上已证实其中的主要成

5、分黄芩苷和黄芩苷元有抑菌、清热、降压、镇静、利尿、利胆、抗炎、解毒及抑制ＨＩＶ病毒逆转录酶活性等作用［３］。随着对植物代谢网络认识的加深，应用基因工程技术对植物次生代谢途径进行遗传改良已取得了可喜的进展。本研究用携带植物高效表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋“解除武装”的重组Ｃ５８Ｃ１工程菌感染粘毛黄芩无菌苗的不同外植体诱导出毛状根，建立粘毛黄芩毛状根的高效外源基因表达系统，以期为其次生代谢产物黄酮类化合物的生物合成关键酶基因导入，并实现产业化大量生产奠定基础。　　１材料与方法　　１．１菌株及植物材料　　重组Ｃ５８Ｃ１工程菌由西南大学廖志华教授

6、惠赠，Ｃ５８Ｃ１本来是根癌农杆菌，经“解除武装”改造后，保留Ｈｅｌｐｅｒ质粒，导入发根质粒ｐＲｉＡ４，改造后的Ｃ５８Ｃ１失去使植物长冠瘿组织的能力，成为发根农杆菌。粘毛黄芩种子购买于山西省绛县远博农副产品公司。　　１．２方法　　１．２．１农杆菌的活化取保存的工程菌Ｃ５８Ｃ１菌种，划线接种于ＹＥＢ固体培养基上，２８℃培养，固体培养基上活化２次。挑取单菌落，接种于ＹＥＢ液体培养基中，２８℃、１５０ｒ／ｍｉｎ培养过夜，当ＯＤ６００ｎｍ＝０．６时进行第4次活化，在ＯＤ６００ｎｍ＝０．３时加１００μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮，继续振荡培养至ＯＤ６００ｎｍ＝０

7、．５，室温下４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，菌体用等体积ＭＳ＋１００μｍｏｌ／ＬＡＳ液体培养基悬浮培养，２８℃、１５０ｒ／ｍｉｎ继续活化３０ｍｉｎ，可用于侵染。　　１．２．２粘毛黄芩无菌苗的获得选取饱满种子用自来水浸泡８ｈ，然后流水冲洗５ｈ，体积分数７５％的乙醇浸泡３０ｓ，无菌水冲洗３次，质量分数０．１％的ＨｇＣl２浸泡１２ｍｉｎ，无菌水洗涤５次，接种于ＭＳ固体培养基上，２５℃连续暗培养。７ｄ后，种子陆续萌发。　　１．２．３毛状根的诱导分别切取４～５ｄ苗的子叶、１４～１５ｄ苗的幼茎和叶片置于ＭＳ无激素固体培养基上进行１ｄ的预培养。

8、将上述外植体在活化好的Ｃ５８Ｃ１菌液中侵染１５ｍｉｎ，取出并吸干多余菌液，放在ＭＳ＋１００μｍｏｌ／ＬＡＳ固体培养基上，共培养２～３ｄ，直到外植体周围出现明显菌斑，