《外源基因的表达》PPT课件

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1、第六章外源基因的表达基因重组的主要目的使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产的目的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。基因工程技术的核心——基因表达技术。基因表达——是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。基因表达在原核生物与真核生物中的差别（1）原核生物表达系统基因表达是以操纵子的形式进

2、行的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA;与此同时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。基因操纵子调节系统示意图调节基因启动基因操纵基因结构基因DNA转录（-）RNA聚合酶（+）转录翻译mRNA翻译阻遏蛋白蛋白质诱导剂控制区信息区操纵子（2）真核生物基因表达系统转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5′和3′末端后才形成成熟的、有功能的mRNA。mRNA只能在细胞质中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，

3、再经过加工、糖化，形成高级结构。第三节外源基因表达系统外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。外源基因表达系统基因表达载体受体细胞基因表达系统原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系统：如酵母表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：原核生物多为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物

4、。基因组结构简单，便于基因操作和分析。多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。一、大肠杆菌基因表达系统大肠杆菌——是一种革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目标基因表达的水平高，培养周期短。目前大多数外源基因都是以大肠杆菌为受体系统进行表达的，是目前应用最广泛的基因表达系统。大肠杆菌表达系统的优越性：①已经掌握了十分丰富的有关大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等

5、方面的背景知识，特别是对其基因表达调控的分子机理有了深刻的了解；②大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；③实验已经证明，许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达；④大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：DNA复制及重组载体的选择系统（复制子、选择标记）外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统1、大肠杆菌基因表达载体（1）DNA复制及重组载体的选择系统①复制子复制子：是一段包含复制起始位点（ori）和

6、反式因子作用区在内的DNA片段。大肠杆菌基因表达载体一般是质粒表达载体，含有能在大肠杆菌中有效复制的复制子。常见的复制子pMB1、p15A、ColE1：松弛复制型，每细胞质粒拷贝数10～20个。pSC101：严谨复制型，每细胞质粒拷贝数少于5个。在同一大肠杆菌细胞内，含同一类型复制子的不同质粒载体不能共存含不同类型复制子的不同质粒载体可以共存②选择标记目的：使转化体产生新的表型，将转化了的细胞从大量的菌群中分离出来。微生物表型选择标记显性标记营养缺陷型标记在基因克隆中绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号，并且主要集中在氨苄青霉素

7、抗性、四环素抗性、链霉素抗性、氯霉素抗性以及卡那霉素抗性等少数几种抗菌素抗性记号上。其原因一方面是由于许多质粒本身就是带有抗菌素抗性基因的抗药性R因子；另一方面则是因为抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。大肠杆菌表达载体上一般都带有一个以上的抗生素抗性基因。表达载体上的抗药性基因赋予宿主特定的抗药性，使其能在抗生素的培养条件下正常生长。这样就可以筛除掉不含载体的宿主，同时保证载体在宿主中的稳定存在。在构建大肠杆菌表达载体的过程中，选择何种抗生素抗性基因，还必须考虑到是否会对特定宿主细胞的代谢活动产生影响。（2）外源目的基因的

8、转录系统这一系统包括启动子、抑制物基因和终止子。启动子和终止子因宿主的不同而有差别，往往在不同的宿主中表达的效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。①启动子启动子（promotor）：是一段能被宿主RNA