外源基因的表达.ppt

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1、第六章外源基因的表达基因工程技术的核心是基因表达技术。基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产目的的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。目前已构建出了多种基因表达系统，包括原核生物表达系统和真核生物表达系统，不同的表达系统具有各自的特点。在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。

2、当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA，与此同时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5′和3′末端后才形成mRNA。而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。基因表达在原核生物与真核生物中的差别？6.1基因表达的机制6.1.1外源基因的起始转录外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列

3、，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。原核生物启动子诱导型启动子：组成型启动子：如lac、trp、λPR、λPL、tac等的启动子如T7噬菌体的启动子真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。6.1.2mRNA的延伸与稳定外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。一方面，要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的mRNA转录提前终止的现象；另一方面，又要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。6.1.3外源基因mRNA的有效翻译外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：

4、AUG(ATG)是首选的起始密码子。SD序列为与核糖体16SrRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3～9个碱基。在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。不同基因组使用密码子具有选择性。主密码子（majorcodon）罕用密码子（rarecodon）如果外源基因mRNA的主密码子与受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因表达的效率就高；反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达效率就低。6.1.4表达蛋白在细胞中的稳定性避免外源基因表达蛋白降解的对策：构建融合蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建包涵体表达系统选择蛋白水

5、解酶基因缺陷型的受体系统6.1.5目的基因沉默基因沉默的作用机制位置效应的基因沉默：转录水平的基因沉默：转录后水平的基因沉默：是指基因在基因组中的位置对其表达的影响是在DNA水平上的基因调控是在RNA水平上的基因调控6.2基因表达的调控元件6.2.1启动子启动子（promoter）：是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列，它位于基因的上游。RNA聚合酶正是通过与它的结合而启动基因的转录。原核基因启动子具有－10和－35序列等结构元件，而真核基因启动子则具有TATA盒及上游元件等特征结构。*启动子的特征序列特异性方向性位置特性种属特异性6.2.1.1原核生物的启动子转录起始位点：大多数细

6、菌启动子转录起始区的序列为CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基（A/G）。Pribnow框：－10bp处的TATA区，又称－10序列区。Sextama框：－35bp处的TTGACA区，又称－35区。间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动子功能的重要因素。TTGACATATAATTranscriptionalstartsite5’3’-35-1016-19bp5-9bpT80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45TheprokaryoticpromoterThesequenceofDNAneededfor

7、RNApolymerasetobindtothetemplateandaccomplishtheinitiationreaction.6.2.1.1真核生物的启动子Ⅰ型：rRNA基因启动子Ⅱ型：mRNA基因启动子Ⅲ型：tRNA基因启动子Ⅰ型启动子所属基因编码的产物为rRNA前体，经剪切加工后成为各种成熟的rRNA分子。人体细胞Ⅰ型启动子核心启动子：上游控制元件（UCE）：紧邻转录起始位点，可以启动基因的转录。