外源基因的表达1

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1、第七章外源基因的表达第一节外源基因在原核细胞中的表达1.原核生物基因表达的特点与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点：（1）原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有三种）识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。（2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。（3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。（4）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。（5）原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。（6）在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及1

2、6S核糖体RNA3’末端碱基互补的序列，即S-D序列，而真核基因则缺乏此序列。2.原核表达系统的注意事项从上述特点可以看出，欲将外源基因在原核细胞中表达，必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和S-D序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件：（1）通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。（2）外源基因不能带有内含子，因而必须用cDNA或化学合成的基因，而不能用基因组DNA。（3）必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基的表达。（4）外源基因与表达载体连接后，必须形

3、成正确的开放阅读框架。（5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的伤害。3.原核生物基因表达的调控序列只有在了解了原核生物基因表达调控序列的基础上，才能够构建高效的表达载体，使外源目的基因在原核细胞中得到高效率、高水平地表达。对于原核细胞来讲，基因表达的调控序列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、增强子、衰减子等序列。（1）启动子启动子(promoter)是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。原核生物的启动子是由两段彼此分

4、开且高度保守的核苷酸序列组成。■-35区（TTGACA）：位于转录起始位点上游的-35bp附近，是RNA聚合酶初始识别和结合位点。■-10区（Pribnow框，TATAAT）：RNA聚合酶结合于此处导致DNA双链形成单链。原核表达系统中通常使用的可调控的强启动子有lac（乳糖启动子）、trp（色氨酸启动子）、PL及PR（λ噬菌体左向和右向启动子）、tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）等。（2）终止子在一个基因或一个操纵子的3’端往往有一个特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一段DNA序列称为终止子（terminator)。终止子在结构上有一些共

5、同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C区域具有回文对称结构，使转录后的RNA具有茎环结构。根据转录终止作用类型，终止子可分为两种：依赖于ρ因子的转录终止子及不依赖于ρ因子的转录终止子。（3）S-D序列S-D序列是位于起始密码子（AUG）上游3~10bp处的由3~9bp组成的序列。这段序列正好与16SrRNA3’端序列互补，是rRNA的识别和结合位点。S-D序列存在与否及S-D序列与起始密码子之间的距离，是影响mRNA翻译成蛋白质的主要因素之一。（4）增强子增强子（enhancer)是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用

6、序列。4.几种类型的原核表达载体在原核细胞中表达外源基因时，由于实验设计的不同，总的来说可以产生融合型和非融合型表达蛋白。不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为非融合蛋白。融合蛋白指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其它DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。（1）非融合型表达蛋白载体pKK223-3具有一个强的tac（trp-lac）启动子，这个启动子是由trp启动子的-35区、lacUV5启动子的-10区、操纵基因及S-D序列组成。紧接着tac启动子的是一个取自pUC8的多位点接头，使之很容易把目的基因定位在启动子和S-D序列

7、之后。在多位点下游的一段DNA序列中，还包含一个很强的rrnB核糖体RNA的转录终止子。载体的其余部分由pBR322组成。（2）分泌型克隆表达载体pINIII系统这个载体系统是由pBR322为基础构建的。带有大肠杆菌最强的启动子之一，即Ipp（脂蛋白基因）启动子。在启动子的下游装有lacUV5的启动子及其操纵基因，并把lac阻遏子的基因（lacI）也克隆到这个质粒上。这样目的基因的表达就成为可调节的了。在转录控制的下游再装上人工合成的高效翻译起始序列（S-D序列及ATG）。信号肽序列取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa（外膜蛋白基因）。在编码序

8、列的下游紧接着一段人工合成的多克隆位点片断，包括三个单一酶切位点，EcoRI、HindIII、BamHI。（3）融合蛋白表达载体pGEX