外源基因的表达(I)

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1、第六章外源基因的表达1基因工程的一个主要目的——基因表达：使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，改变生物性状或产生人们所需要的产品（如：蛋白质、多肽类生物药物）。基因表达——是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下翻译成蛋白质，蛋白质经过修饰后，最终表现出相应的功能。基因表达的过程——包括转录、转录后加工、翻译及翻译后加工。它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。2第一节基因表达机制1.1基因表达机制概述基因表达必备的条件：基因能够转录：要求基因上游有“启动子”，调控元件、下游有“终止子”。转录产生的mRNA能够有效加工并保持稳定。翻译产生的蛋白质能

2、够有效加工并保持稳定。避免出现基因沉默31.3mRNA延伸和稳定性转录启始后,RNA聚合酶延伸mRNA,至终止子处终止。mRNA应在细胞中保持稳定的拷贝数：mRNA有半衰期，必须不停转录，才能保持稳定的拷贝数。基因上游有启动子，一般应为诱导型；存在有效的诱导剂；没有阻遏物。1.2外源基因的起始转录41.4mRNA的加工真核生物mRNA转录后需要剪切和拼接的加工过程。原核生物mRNA有效翻译需考虑的基本原则：AUG（ATG）为起始密码子SD序列应包括AGGAGG中的4个.SD序列与起始密码子间距3-9bp起始区周围序列无二级结构.外源基因的主密码子与受体细胞的相同或接近.主密码子:基因

3、组中使用频率高的密码子罕用密码子:使用频率低的终止密码:E.coli.一般用UAA.RF1识别UAA,UAG.RF2识别UAA,UGA.1.5mRNA的翻译5基因转录、翻译的动画演示真核生物基因转录、转录后加工及翻译过程原核生物基因的转录起始、转录、翻译过程6避免表达蛋白降解的方法:采用融合蛋白表达系统采用分泌蛋白表达系统构建包涵体表达系统选择无蛋白水解酶的受体。1.6表达蛋白的稳定性7基因沉默的形成机制主要有三种：位置效应的基因沉默：整合入甲基化程度高、转录活性低的异染色体上，一般不表达。转录水平的基因沉默：启动子的甲基化或外源基因的异染色质体。转录后水平的基因沉默：RNA水平上,

4、基因可转录,但mRNA合成后被降解或被反义RNA或蛋白质封闭.转基因植物和转基因动物中常见。1.7基因沉默8序列特异性：几个保守的序列框。方向性：启动子正反两种方向中只有一种具有启动功能。位置特性：启动子只能位于所基因的上游或基因内的前端。种属特异性：不同种属、不同组织的启动子不同。第二节基因表达的调控元件2.1启动子9原核生物启动子转录起始位点:多为CAT,从第二个碱基开始。-10区：TATAAT，一般在起始位点上游6bp处。-35区：TTGACA，一般在起始位点上游35bp处。其中前个碱基高度保守间隔区：-10区与-35区存在长度不等的间隔区，序列无保守性，间隔的长度非常重要。一

5、般间隔16-18bp，E.coli.为17bp最好。真核生物启动子10能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列。结构与启动子类似，由多个元件组成，每个元件与一种或多种转录调控因子结合。转录调控区通常有一至多个增强子。每个均有一种特定的功能：如在特定的发育阶段起作用。2.2增强子增强子的特性双向性：正反方向均可重复序列：独立行使功能功能的行使与位置无关：可上游、下游或中间特异性：功能行使有组织特异性或发育阶段特异性。可调节同源基因，也可调节异源基因。11转录终止的位置分为本征终止子和依赖终止信号的终止子两类。2.3终止子调节转录的起始和终止.Trp操纵子2.4衰减子12第三节外源基因

6、表达系统外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。3.1定义13原核生物基因表达系统真核生物基因表达系统基因表达载体受体细胞3.2种类外源基因表达系统基因表达载体受体细胞14原核生物基因表达系统大肠杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统链霉菌表达系统蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系统酵母表达系统植物细胞表达系统昆虫细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统外源基因表达系统3.2种类表达载体受体细胞153.3原核生物与真核生物间基因表达的差别原核生物基因表达真核生物基因表达转录加工翻译加工修饰转录加工翻译加工修饰16原核生物表达

7、系统基因表达：以操纵子形式进行。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA;与此同时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。真核生物基因表达系统转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5′和3′末端后才形成成熟的、有功能的mRNA。mRNA只能在细胞质中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化，形成高级结构。3.3原核生物与真