基因工程外源基因的表达

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1、第十章外源基因的表达生物科学与技术学院原核表达系统正确表达的基本条件常用的大肠杆菌表达载体的元件外援蛋白质表达部位提高外源基因表达效率的方法表达产物的检测大肠杆菌表达外源基因的优势和劣势优势：全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物劣势：缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素正确表达的基本条件外源基因不能带有间隔序列（内含子），不能用基因组DNA

2、，要用cDNA或者合成的人工DNA。必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达。外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放式阅读框架。通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。表达载体的组成启动子转录终止子翻译起始序列翻译增强子原核表达系统中通常使用的可调控的强启动子有lac（乳糖启动子）、trp（色氨酸启动子）、PL及PR（λ噬菌体左向和右向启动子）、tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）等。启动子-35区序列-10

3、区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtraATAGACATAATGTPlLTTGACAGATACTPrecATTGATATATAATLac表达系统以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统。转录调控机理具有多顺反子结构，基因排列次序为：阻遏基因（lacI）-启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）正调节因子CAP（活化蛋白）负调节因子lacI（阻遏蛋白）lacIPlaclacOlacZlacYlacA高效转录cAMPCA

4、PlacIPlaclacOlacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录RNA聚合酶基因工程中使用的lac启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAPlacUV5突变体PlacUV5突变体能够在没有CAP（活化蛋白）存在的情形下非常有效的起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受lacI的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作。负调节因子lacI在无诱导物情形下，lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。lacIPla

5、clacOlacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录lacIPlaclacOlacZlacYlacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNATac表达系统tac启动子是由trp的–35序列和lacUV5的–10序列拼接而成的杂合启动子。调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于trp和lacUV5启动子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。lac、tac启动子对宿主菌的要求在普通大肠杆菌中，LacI阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac操纵子转录调控

6、的需要。当多拷贝的lacO随着带有lacUV5、tac启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI阻遏蛋白与lacO的比例显著下降，无法保证每一个lacO都能获得足够的LacI阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下，lacUV5、tac启动子有较高的本底转录。为了使以Lac、Tac表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的LacI阻遏蛋白的lacI基因的突变体lacIq被应用于表达系统。大肠杆菌JM109等菌株的基因型均为lacIq，常被选用为Lac、Tac表达系统的宿主菌。但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严

7、紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。需在表达载体中插入lacIq基因以保证有较多的LacI阻遏蛋白产生。Trp表达系统以大肠杆菌trp操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统。转录调控机理色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因表达。PtrpOtrpRNA聚合酶基底水平转录高效转录mRNAPtrpOt

8、rp去除色氨酸高效转录mRNAPtrpOtrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为