外源基因表达与基因工程药物01知识讲解.ppt

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1、外源基因表达与基因工程药物01siRNA（小干扰RNA）：21-23nt，由长dsRNA裂解而成的小片段，可诱导mRNA降解。siRNA主要参与抵御外源性病毒核酸的侵染。细胞中存在两种RNA干扰现象：miRNA（微小RNA）：由miRNA前体剪切而成，可抑制mRNA翻译。miRNA主要参与内源性基因的表达调节。RNA干扰（RNAinterference,RNAi）siRNA(小干扰RNA)miRNA(微小RNA)来源siRNA是外源性的，是RNA干扰的中间产物miRNA是内源的是生物体固有结构si

2、RNA是双链RNAmiRNA是单链RNADicer酶加工过程对称地来源于双链RNA不对称加工，仅剪切miRNA的侧臂作用位置siRNA可作用于mRNA的任何部位miRNA主要作用于靶标基因3′端非翻译区（3’-UTR）作用方式siRNA一般导致靶mRNA的降解，即为转录水平后调控。miRNA可抑制靶mRNA的翻译，也可以导致靶mRNA降解，即在转录后水平和翻译水平起作用作用阶段siRNA不参与生物生长，主要作用是抑制病毒感染miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达RNA干扰技术的应用基因

3、治疗（基因失活性治疗）（1）病毒感染性疾病通过RNAi抑制RNA病毒复制基因功能研究（功能失活策略）（2）基因过表达引起的疾病（如肿瘤）siRNA药物RNA干扰技术的实施策略体外合成siRNA、体内转录shRNA基因打靶(genetargeting)利用同源重组原理对细胞特定内源基因进行改造的技术。基因敲除（geneknockout）：宿主基因组中特定功能基因的部分片段被同源的外源DNA片段替代，从而使靶基因失活。基因敲入（geneknockin）：外源功能基因与宿主基因组中的同源序列进行同源重组

4、，插入到基因组中，从而在细胞内获得表达。基因打靶（genetargeting）基因敲除小鼠的产生1.体外构建基因敲除载体：靶基因同源DNA序列+选择性标记基因2.将基因敲除载体导入ES细胞：显微注射法、电穿孔法等3.筛选、鉴定发生了同源重组的ES细胞：标记筛选法、分子鉴定法4.将ES细胞导入胚胎，胚胎植入假孕雌鼠的子宫5.小鼠交配传代获得特定的纯合基因型子代小鼠Lepr8基因敲除小鼠比野生型小鼠（WT）出现明显体重增加现象REGγ基因敲除鼠（下图）出现脊椎弯曲等早衰现象Gab1基因敲除导致小鼠缺血

5、性血管新生、侧枝循环建立出现缺陷（图示上半部分），主要是由于血管内皮细胞管状结构形成的信号调控通路出现障碍而引起的（图示下半部分）。酪氨酸酶基因敲除后，本来是黑色的小猪，变成了白色，表现出典型的白化病特征。基因编辑（geneediting）对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。CRISPR/Cas系统：由CRISPR基因座与其串联的Cas基因组成，通过序列特异的RNA介导，切割降解DNA。Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromi

6、crepeats(CRISPR)/Cas9CRISPR：成簇规律间隔性短回文重复序列Cas：CRISPR相关基因RNA干扰（RNAi)siRNA、miRNARNA干扰技术策略、应用基因敲除基因编辑常用分子生物学技术：RNA干扰、基因敲除小结作业比较RNA干扰与基因敲除的异同点，简述它们在药学中的应用。第十一章外源基因表达与基因工程药物基因工程药物重组人胰岛素重组人白细胞介素-2重组人干扰素外源基因表达：利用分子生物学技术，在体外将外源基因重组至合适表达载体上，通过有关技术将其导入宿主细胞，借助宿主

7、细胞内系统，合成具有生物活性的蛋白质。基因工程技术：基因克隆（上游技术）+外源基因表达（下游技术）基因克隆上世纪70年代发展起来的一种分子生物学技术，也称分子克隆。通过相应技术手段，将目的基因导入宿主细胞，并在宿主细胞内大量复制。按步骤可概括为∶分、切、连、转、筛。切连转筛获取目的基因和载体目的基因和载体连接重组DNA导入受体细胞重组体的筛选与鉴定分限制酶切割基因克隆一、目的DNA的分离获取（分）二、载体的选择与限制酶切（切）三、目的DNA与载体连接（连）四、重组DNA转入受体细胞（转）五、重组体

8、的筛选与鉴定（筛）基因克隆五个基本部分（一）目的基因的获得1、化学合成适用于合成分子量较小的目的基因2、PCR及RT-PCR合成序列已知的基因3、基因组文库与cDNA文库包含全面的基因和mRNA信息适用于合成分子量较小的目的基因（100bp以内），如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列，再用DNA合成仪人工合成目的基因。1、化学合成DNA片段2、PCR与RT-P