第十章外源基因表达与基因工程药物

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1、第十章外源基因表达与基因工程药物第一节概述外源基因的表达：利用细胞内相关酶系及其调控系统，将外源基因转录成肽链或加工成活性蛋白质的过程。具体的说，利用分子生物学技术，在体外将编码外源蛋白质的基因重组至适宜的表达载体上，通过相关技术将其导入宿主细胞内，借助宿主细胞的转录、翻译或翻译后修饰酶系及相应的调控系统，在宿主细胞合成或分泌具有原有生物活性的蛋白质。目的：针对难以或无法从自然界直接提取、分离、纯化所获得的，或制造成本、产量规模等受限制的，或利用化学方法无法合成的多肽，蛋白质、酶这类生物分子药物，利用细胞或组织或器官或生命体的复制、转录、翻译及其调控系统以及翻译后加工、修饰等体

2、系，按人的意愿生物合成这些生物分子，并从中将表达产物分离纯化至预期程度，最终加工成药品。基因工程概念基因工程(geneticengineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程，从而改变生物特性或创造新的生物类型的技术基因工程的发展史一、基因表达基本原理基因表达(geneexpression)是指储存遗传信息的基因在各种调节机制下经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录和翻译，产生有生物活性的蛋白质过程。基因工程技术的核心是基因表达技术。基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中

3、能得到高效表达。基因表达在原核生物与真核生物中的差别原核生物与真核生物肽链合成过程的主要差别原核生物真核生物mRNA一条mRNA编码几种蛋白质（多顺反子）一条mRNA编码一种蛋白质（单顺反子）转录后很少加工转录后进行首尾修饰及剪接转录、翻译和mRNA的降解可同时发生mRNA在核内合成，加工后进入胞液，再作为模板指导翻译核蛋白体30S小亚基＋50S大亚基↔70S核蛋白体40S小亚基＋60S大亚基↔80S核蛋白体起始阶段起始氨基酰-tRNA为fMet-tRNAfMet起始氨基酰-tRNA为Met-tRNAiMet核蛋白体小亚基先与mRNA结合,再与fMet-tRNAfMet结合核蛋

4、白体小亚基先与Met-tRNAiMet结合，再与mRNA结合mRNA中的S-D序列与16SrRNA3-端的一段序列结合mRNA中的帽子结构与帽子结合蛋白复合物结合有3种IF参与起始复合物的形成有至少10种eIF参与起始复合物的形成延长阶段延长因子为EF-Tu、EF-Ts和EF-G延长因子为eEF-1α、eEF-1βγ和eEF-2终止阶段释放因子为RF-1、RF-2和RF-3释放因子为eRF蛋白质合成的特点1.真核生物的蛋白质合成与mRNA的转录分开进行原核生物的蛋白质合成与mRNA的转录偶联在一起同时进行2.真核生物中的mRNA为单顺反子原核生物中的mRNA为多顺反子3.真核

5、生物合成体系中的RNA和蛋白质在结构上与原核生物不同，且其线粒体有独立的蛋白质生物合成体系阻遏蛋白介导的负调控和cAMP-CAP介导的正调控共同担负着原核生物体内糖源的协调利用翻译水平的调控是对原核生物转录水平的补充1.转录与翻译的偶联提高了基因表达调控的有效性2.SD序列影响翻译起始速率3.翻译阻遏利用蛋白与自身mRNA的结合实现翻译起始的调控4.mRNA密码子的编码频率影响翻译的延伸速度基因表达调控的影响因素——原核生物（一）真核生物染色质结构影响基因转录1.转录活化的染色质对核酸酶极为敏感2.转录活化的染色质的组蛋白发生改变3.RNA聚合酶结合位点的上游和下游具有不同的超

6、螺旋构象4.CpG岛甲基化水平降低（二）顺式作用原件（启动子、增强子和沉默子）直接影响基因表达活性（三）转录因子的调控（四）真核生物在转录后仍可控制mRNA的结构和功能，其在转录后层次不同于原核生物基因表达调控的影响因素——真核生物目标蛋白性质是否需要糖基化三维结构复杂程度简单结构复杂的三维结构原核表达系统真核表达系统是否二、基因表达基本类型原核细胞表达系统真核细胞表达系统大肠杆菌系统，芽孢杆菌系统等产物溶解情况表达位置产物结构状态转基因动植物酵母细胞、昆虫细胞和动物细胞等包涵体可溶性胞内定位表达分泌表达非融合表达融合表达第二节外源基因表达基本过程将外源基因通过体外重组后导入受

7、体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达【四个要素】工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞基因工程的基本过程目的基因的获取：从生物体中分离或人工合成重组载体的构建：对目的基因和载体DNA进行剪切、修饰，在连接酶的作用下连接形成完整有复制能力的重组体重组DNA分子导入合适的受体细胞：重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增基因工程的基本过程重组体的筛选与鉴定：直接筛选法(如抗药标志选择)和免疫学方法目的基因的表达及分离纯化：原核与真核表达一、目的基因的获得外源基因表达的第一步是获得目的基