外源基因的表达系统课件.ppt

《外源基因的表达系统课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第八章外源基因的表达系统第一节基因表达的机制第二节外源基因表达系统表达系统克隆的基因只有通过在宿主细胞中表达才能进一步研究其功能和调控机理，同样，也只有通过其表达才能获得具有特定生物活性的目的产物。这种表达外源基因的宿主细胞就叫表达系统，它可分为原核(主要是大肠杆菌)表达系统和真核(酵母、昆虫细胞、哺乳类动物细胞、植物细胞)表达系统两类。要使克隆基因在宿主细胞中表达，就要将它插入带有基因表达所需要的各种元件的载体中，这种裁体就称为表达载体。对不同的表达系统，需要构建不同的表达载体。基因表达遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（centraldogma）。克隆基因的表达

2、外源基因在宿主细胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。第一节基因表达的机制1外源基因的起始转录2mRNA的延伸与稳定性3外源基因mRNA的有效翻译4表达蛋白在细胞中的稳定性5目的基因沉默1外源基因的起始转录外源基因在宿主细胞中的有效表达是基因工程的核心问题，而外源基因的起始转录又是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。一般来说，理想的可调控的启动子在细胞生长的初期不表达或低水平表达，当细胞增殖达到一定的密度后，在某种特定

3、的诱导因子(如温度、光和化学药物等)的诱导下，RNA聚合酶开始启动转录,合成mRNA。原核生物基因表达的启动子可分为:诱导型启动子和组成型启动子(前者如lactrp等的启动子,后者如T7噬菌体的启动子)。真核生物基因表达的启动子可分为：诱导型、组织特异型和组成型等类型。2mRNA的延伸与稳定性转录后,保持mRNA的有效延伸、终止及稳定是基因有效表达的关键。在转录物内的衰减和非特异性终止都可诱发转录中的mRNA提前终止。衰减子(attenuator)类似于简单的终止子,在原核生物中一般位于操纵子的启动子与第一个结构基因之间。在构建表达载体时要尽量避免该序列的存在。为了防止mRNA

4、在转录过程中的非特异性终止可以在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。另一方面，存在正常转录终止序列也是外源基因有效表达的重要因素，它可以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。对于真核细胞来说，表达载体上含有转录终止序列和poly(A)掺入位点是外源基因表达的重要条件。poiy(A)掺入的信号序列AAUAAA对mRNA3‘端的正确加工至关重要，AAUAAA位点的缺失甚至可以导致基因表达的减少。mRNA的稳定性直接决定翻译产物的多少。对原核细胞来说,最佳的方法是选择一个RNase缺失的受体菌。对真核细胞来说,则需要考虑增加mRN

5、A的正确加工,提高成熟mRNA的稳定性。3外源基因mRNA的有效翻译在原核细胞中影响翻译起始的因素有:起始密码子、核糖体结合位点(SD序列)、起始密码与SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5'端非翻译序列和蛋白编码区的5'端序列等。因此,外源基因mRNA有效翻译须考虑下列基本原则:mRNA有效翻译须考虑的基本原则①AUG(ATG)是首选的起始密码子。②SD序列为与核糖体16SrRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。③SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3～9个碱基。④在翻译起始区周围的序列不易形成明显的二级结构。对于真核细

6、胞mRNA的5‘非翻译区不存在SD序列，但绝大多数mRNA的起始序列都含有共同的序列5’-CCA(G)CCATGG-3‘，如果改变这一序列，可使翻译的起始效率大大降低。此外，在起始密码ATG的上游区域含有另一个起始密码而又不被随后的一个符合阅读框的终止密码所终止，则该起始密码会影响mRNA翻译的起始。4表达蛋白在细胞中的稳定性外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶所水解是基因有效表达的一个重要因素。如果表达的外源蛋白具有相同或类似于宿主细胞天然蛋白的构象,则被降解的可能性就会大大降低。避免外源基因表达蛋白降解①构建融合蛋白表达系统：在融合蛋白中外源蛋白与

7、受体细胞蛋白能形成良好的杂合构象，它能在较大程度上封闭外源蛋白分子上的水解酶作用位点，从而增加其稳定性。②构建分泌蛋白表达系统：使外源基因表达的蛋白质分泌到细胞周质腔或直接分泌到培养基中，避免细胞内的水解酶对表达蛋白的降解。③构建包涵体表达系统：外源基因的表达产物以包涵体的形式存在于受体细胞中不易被宿主蛋白水解酶所降解。④选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统。5目的基因沉默基因沉默(genesilencing)是导致外源基因不能正常表达的重要因素。其作用机制主要有三种：位置效应的基因沉默、转录