葛根素对lps诱导raw264.7细胞炎性细胞因子表达的影响及机制

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温州医学院硕士学位论文一、论文摘要题名葛根素对LPS诱导脚264．7细胞炎性细胞因子表达的影响及机制(中文摘要)研究目的通过观察葛根素(Puerarin)预处理对细菌脂多糖(Lipopolys—accharide，LPS)体外诱导激活小鼠巨噬细胞RAW264．7后细胞的形态变化、细胞内核转录因子．Id3(nuclearfactor-rB,NF．r,B)及炎性细胞因子表达的影响，探讨其抗炎机制，为葛根素应用于急性肺损伤(AcuteLungInjury，ALl)／急性呼吸窘迫综合征(AcuteRespiratoryDistressSyndrome，ARDS)的临床治疗提供理论依据。方法1、细胞分组取对数期生长良好的细胞随机分为空白对照组、LPS模型组(LPS1ug／mL)、葛根素预处理+LPS组(葛根素100、200、400umol／L预处理细胞24h后，换含LPS1ug／mL培养基孵育细胞24h)。各组在相同的时间点加入LPS(空白对照组加入等量PBS)。2、采用CCK．8法测定不同浓度葛根素和LPS对巨噬细胞RAW264．7活性的影响，以选择合适浓度；以检测的吸光度(Absorbance，A)值大小作为细胞相对数量的比较。3、Giemsa染色，光学显微镜下观察巨噬细胞形态学改变。4、采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞上清液中MIP·2、TNF-a表达水平。5、采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)动态测定NF-v,Bp65mRNA的表达。结果1、采用CCK．8法检测及改进寇氏法计算葛根素的最大无毒浓度(TC0)为520．361urnol／L，半数毒性浓度(TC50)为5451．77umol／L。当葛根素的浓度为100，200，400umol／L时，与lug／mLLPS共培养均未显示出细胞毒性作用(P<0．05)。2、倒置显微镜下观察，未经LPS刺激的RAW264．7细胞体积较小，成球形，少部分成梭形。LPS(1ug／mL)刺激后细胞形态向成树突状改变(具体表现 温州医学院硕士学位论文为胞体增大，形态不规则，伪足大量伸出)，葛根素100umol／L组干预后可明显抑制LPS导致的细胞形态学变化，葛根素200和400umol／L干预组的抑制效果更显著，但最大剂量组仍未达到LPS刺激前的形态。3、LPS组细胞上清中TNF．Q及MIP．2的水平(310．51±26．98pg／mL、384．28+42．59pg／mL)比正常组(41．46+11．68pg／mL、34．81±9．36pg／mL)明显增高，差异存在统计学意义(P0．05)(图1)。图1．葛根素和LPS对RAW264．7细胞CCK-8的A值的影响Figure1．EffectsofPuerarinandLPSonAvalueofCCK-8inRAW264。71．20细1．00胞活o．80力。，。0．60—一、Ao．40、一0．20瑚匹!MLPS100xtmoFL200、tmoⅥ．400umd几3．细胞形态学检测倒置显微镜下观察，未经LPS刺激的RAW264．7细胞体积较小，成球形，少部分成梭形。LPS(1ug／mL)刺激后细胞形态向树突状改变(具体表现为胞体增大，形态不规则，伪足大量伸出)，葛根素100umol／L组干预后可明显抑传IJLPS导致的细胞形态学变化，葛根素200和400umol／L干预组的抑制效果更显著，但最大剂量组仍未达至IJLPS刺激前的形态(图2．1，图2．2，图2．3，图2．4，图2．5)。 温州医学院硕士学位论文图2．1Giemsa染色法检测正常对照组RAW264．7细胞形态学变化(400×)Fig．2-1ThemorphologyofRAW264．7incontrolgroupbyGiemsastain(400×)图2—2Giemsa染色法检澳I]LPS组RAW264．7细胞形态学变化(400×)Fig．2-2ThemorphologyofRAW264．7inLPSgroupbyGiemsastain(400×)18 温州医学院硕士学位论文图2—3Giemsa染色法检测葛根素100umol／L组RAW264．7细胞形态学变化(400×)Fig．2-3ThemorphologyofRAW264．7inPuerarin(100umol／L)groupbyGiemsastain(400×1图2．4Giemsa染色法检测葛根素200umol／L组RAW264．7细胞形态学变化(400×)Fig．2-4ThemorphologyofRAW264．7inPuerarin(200umol／L)groupbyGiemsastain(400×119 温州医学院硕士学位论文F≮舅懑‘‰撩j图2．5Giemsa染色法检测葛根素400umol／L组RAW264．7细胞形态学变化(400×)Fig．2—5ThemorphologyofRAW264．7inPuerarin(400umol／L)groupbyGiemsastain(400×)4．胞培养上清液中TNF．Q和MIP．2的浓度测定ELISA检测结果显示，同正常对照组相比，LPS(1ug／mL)刺激24h后RAW264．7细胞上清液中TNF．Q及MIP．2含量显著升高(P<0．05)，而经过不同浓度的葛根素(100、200、400umol／L)预处理24h后，RAW264．7细胞上清液中MIP．2、TNF．Q的释放较LPS组受到明显抑制(P<0．05)，并呈现一定的剂量依赖性。(表1)(图3．1，图3．2)表1葛根素对RAW264．7细胞MIP．2、TNF．Q分泌的影响(夏±s，n=6)TablelE丘-ectofPuerarinonsecrectionofMIP．2andTNF一0【inLPS．treatedRAW264．7cells()C±S，n=6)与模型组比较：木P<0．05；与空白对照组比较：jfj6P<0．05P<0．05VSmodelgroup；撑P<0．05VSblankcontrolgroup20 图3．1葛根素对RAW264．7细胞TNF．Q分泌的影响(瓦±s，n-6)RAW264·7cellsFig．3．1Effect。fPuerarin。nsecrecti。n。fTNF-0【inLPS-treated(夏±s，n-6)：呈置、。，甲kZI-"TI 5．RAW264．7细胞NF．KBp65mRNA表达Ct值(thresholdcycle，循环阈值)即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。将各组Ct值经统计学处理，具有统计学差异的(P<0．05)，行2．△△Ct公式法相对定量，结果以相对倍数表示(表3)。同正常对照组相比，LPS组中NF．r．Bp65表达量明显上升，达到正常对照组的12．99倍，而经过葛根素100umol／L预处理后，NF一1出p65的释放受到明显抑制，下降到正常对照组的6．49倍，葛根素200和400umol／L干预组的抑制效果更显著，并且葛根素各亚组间Ct值具有统计学差异的(P<0．05)，但最大剂量组NF．r．Bp65的释放仍未达到LPS刺激前的水平(P<0．05)。表3各组RAW264．7细胞NF—r．Bp65mRNA相对表达量Table3TherelativeexpressionofNF-r．Bp65mRNAinRAW264．7cells 温州医学院硕士学位论文分析与讨论ALI／ARDS具有发作快，进展迅猛和预后差的特点，目前ARDS诊断仍广泛沿用1994年欧美联席会议提出的标准：①急性起病；②氧合指数(Pa02／Fi02)<200mmHg[不管呼气末正压(PEEP)水平]；③肺动脉嵌顿压<18mmHg，或无左心房压力增高的临床证据；④正位X线胸片显示双肺斑片状阴影。如Pa02／Fi02<300mmHgJ|．满足上述其他标准，则诊断为ALI【2J。作为临床上一种常见的综合征，其发病机制极其复杂，迄今尚未阐明。近年来随着失控的炎症反应引发ALI／ARDS这一中心机制被广泛接受，参与炎症反应的炎症细胞和细胞因子及其可能的信号转导途径成为了研究的热点。在引起ALI／ARDS的众多肺内、外因素中，由LPSi3J起的重症肺炎是导致直接肺损伤的主要原因。LPS(1ipopolysaccharide，脂多糖)为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，由脂质A(LipidA)、核心多糖和O．特异性链三部分组成(图1)。其中脂质A是其中结构最稳定的部分，同时也是LPS的关键毒性部分【l¨。细菌将LPS以一种聚集体的形式释放出来，在内毒素结合蛋白(1ipopolysaccharidebindingprotein，LBP)的催化下解离成单体形式，并进一步在LBP协助下与细胞膜表面的CDl4结合，形成LPS—LBP．CDl4复合物【1819】，活化后的LPS复合体即可通过复杂的信号转导途径诱导包括巨噬细胞、内皮细胞等各种效应细胞激活，释放大量的细胞因子、炎症介质及其他活性物质，诱发机体的天然免疫和特异性免疫[20-221。研究表明LPS可损伤肺泡上皮，增加肺泡上皮通透性，可通过非酶促反应产生大量的氧自由基作用于内皮细胞和血管平滑肌细胞而诱导ALI的发生【231。同时LPS诱导的过量的TNF．0【，IL一113，IL．6，IL．8等炎症介质将通过细胞．细胞因子间的正反馈效应，进一步加重了ALI的发展。这一点也在本研究中得到了证实，本研究发现未经LPS束IJ激的巨噬细胞仅产生极其微量TNF．a和MIP．2，并且细胞体积较小，成球形，少部分成梭形。经LPS束IJ激24小时后，巨噬细胞释放TNF．a及MIP．2的能力明显加强，同时胞体明显增大，形态不规则，伪足大量伸出。表明了LPS诱导了巨噬细胞的炎症性反应。23 温州医学院硕士学位论文O-anligenCorepolysacchaddeOisaccharidediphosphaZeUpidAo、^“““_，^“““O＼、一夕、(一、＼_／、、弋<<．SbuctureofIIpopotysacchartde图1脂多糖结构目前TNF(TumorNecrosisFactor，肿瘤坏死因子)家族已发现了包括TNF．a、CD27L、CD30L、OX40L等在内的19种因子【241。但作为炎症级联反应中至关重要的因子，TNF．a仍是其中最重要的一员。TNF．a主要由单核巨噬细胞系产生，当病原体等外在因素作用后具有双重作用，适量的表达可提高白细胞对病原体的清除能力，但过量释放对机体却具有强烈的毒性。研究发现经LPS诱导的ALI模型中，TNF．0c及IL一1p将在30—90min内升高，是最先升高的炎症因子[25]，这一点也在高氧诱导的新生SD大鼠ALI中得到了证实【261。作为“起始因子”的TNF．Q随即在细胞和亚细胞水平上激发一系列级联反应，调控炎症反应并促进其他炎症因子及氧化代谢产物的释放【2¨。此外，TNF．0【参与肺部炎症的损伤和修复还表现在促使巨噬细胞和中性粒细胞的趋化及附壁、刺激成纤维细胞的增生、调节中性28粒细胞在内的多种细胞的凋亡等[25291。趋化因子是一组具有吸引免疫细胞沿着其浓度梯度迁徙到免疫应答局部的细胞因子，是唯一与G蛋白偶联受体相结合的细胞因子家族，分子量8～10kDa。根据其半胱氨酸残基的数目和排列方式可分为C．x．C、CC、C、C．X3．C四个亚族p，鼠类MIP一2(macrophageinflammatoryprotein一2，巨噬细胞炎性蛋白一2)由Wolpe于1988年首次发现并命名【3¨，分子量为6KD，由激活的单核巨噬细胞、中性粒细胞和血管内皮细胞分泌，属于C—X．C亚族，作为与人类IL一8结构和功能上同源的趋化因子[321，能够特异地趋化中性粒细胞㈣，而PMN肺内的聚集和活化是ALI／ARDS发生、发展过程中最重要的事件，因此MIP．2的改变在ALI／ARDS中具有重要意义。既往研究发现将MIP．2注射大鼠气管内可导致PMNs在肺组织的明显积聚及组织液渗出[341，此外在机械通气诱导的大鼠ALI模型的BALF中也发现24 温州医学院硕士学位论文MIP．2的显著升高，而使用MIP．2抗体干预后，ALI的严重程度明显下降p引。作为鼠类中性粒细胞特异性的趋化因子，MIP．2一方面通过增强中性粒细胞表面132整合素的表达，增强中性粒细胞与微血管内皮细胞间的粘附作用【36’，另一方面还可以与自身的诱发剂及PMN靶细胞展开相互诱导，促进炎症反应加剧p¨。找出关键的信号通路，一直是ALI／ARDS研究的目标。在所研究的ARDS的相关通路中。NF．1出的作用备受关注。NF．1出广泛存在于多种类型的细胞中，是一类能与多种基因特异性结合并促进其转录的蛋白质，自1986年由sen和baltimore发现以来【38】，受到了国内外广大学者的深入关注。研究发现其在炎症部位高度表达【391，提示NF．1出在免疫和炎症反应中起着关键作用。NF—rd3／Rel家族的成员包括NF．心1(p50／p105)，NF—r,B2(p52／plOO)，p65(RelA)、RelB和c—Rel。以同源或异源二聚体的形式存在，典型的NF．1出为p65／p50异源二聚体结构。静息状态下NF．1出与Ir．_B结合，以非活性的形式存在于胞浆中。活化的NF．r,B与Ir,B脱离后在p65亚单位核定位序列的引导下进入胞核，与特定基因启动子区的1出位点结合，启动相关基因的转录[40】。目前认为NF．KB是ALI炎症反应的主要炎症介质和转录因子，在细胞因子瀑布效应中发挥着开关作用。NF一心的持续活化与肺损伤的严重程度有关，在ALI的炎症介质网络调控中起中心环节作用【411。本实验发现经LPS刺激后，巨噬细胞内的NF—v,Bp65mRNA升高显著(比对照组升高12．99倍左右)，与经LPS刺激后TNF．a及MIP．2的升高比例呈一定的对应关系，猜测NF．1①可能是LPS活化巨噬细胞产生炎症介质的重要通路。葛根素是豆科葛属植物葛根中异黄酮的主要有效成分，化学名为4，7-二羟基．8．13．d．葡萄糖基异黄酮，分子式为C2lH2009，既往研究表明葛根素能明显改善缺血心肌线粒体的肿胀、嵴断裂等损伤性变化【421。葛根素通过保护血管内皮细胞、抗氧化、清除氧自由基等环节而具有抗动脉粥样硬化的作用Ⅲ44’。此外研究发现葛根素可以减少内皮细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)，同时增加丙二醛(MDA)和血栓烷A2(TXA2)作用，说明葛根素对脂质过氧化所致的内皮细胞的损伤有保护作用【451。但目前对葛根素抗炎及其可能的机理研究较少，对其能否应用到呼吸重症医学的研究尚待深入。本实验通过观察不同浓度葛根素干预后，对LPS诱导的巨噬细胞活化的干预作用，探讨其抗炎作用。结果显示葛根素可呈浓度依赖性的下调TNF．Q及MIP．2炎症因子的过度表达。这与其对巨噬细胞内的NF．1cB的表达的影响存在着一定的对应关系，推测葛根素是通过对NF．1出表达的调控达到对抗炎症因子过度释放的目的。此外，葛根素通过抑制巨噬细胞增大，伪足增多等形态学的改变，降低了其吞噬能力，进一步达到对抗炎症的目的。 温州医学院硕士学位论文综上所述，葛根素预处理可抑制NF—r．Bp65表达，进而降低其下游炎症因子TNF．a及MIP．2的分泌，发挥抗炎作用。然而，葛根素具体是作用在哪些转导通路，发挥其抗炎作用。还需要进一步研究证实。本实验通过LPS诱导巨噬细胞活化，成功复制炎症反应模型，研究不同剂量葛根素预处理对炎症因子及趋化因子的作用及巨噬细胞形态学的改变。探讨葛根素的抗炎作用及可能的机制。研究表明：1、LPS可诱导巨噬细胞RAW264．7形态学改变，增加炎症反应能力，而不同浓度的葛根素作用后，可不同程度的抑制LPS诱导的这种形态学改变。2、LPS可明显增加巨噬细胞RAW264．7释放TNF．a及MIP．2的水平，经葛根素作用后，TNF．a及MIP．2的释放明显抑制，并呈现一定的浓度依赖性。3、葛根素可下调经LPS活化的巨噬细胞RAW264。7内NF．r．Bp65mRNA的表达，可能是其抗炎作用的机制之一。 温州医学院硕士学位论文参考文献LAshbaugh，D．G，D．B．Bigelow,T．L．Petty,eta1．，Acuterespiratorydistressinadults．Lancet，1967．2(7511)：P．319-23．乞Bernard，G．R．，A．Artigas，K．L．Bri【ghana，eta1．，TheAmerican-EuropeanConsensusConferenceonARDS．Definitions，mechanisms，relevantoutcomes，andclinicaltrialcoordination．AmJRespirCritCareMed,1994．149(3Pt1)：P．818-24．爻Ware．L．B．andM．A．Matthay,The口c甜耙respiratorydistresssyndrome．NEnglJMed，2000．342(18)：P．1334-49．乱Rubenfeld，G．D．，eta1．，Incidenceandoutcomesofacutelunginjury．NEnglJMed，2005．353(16)：P．1685-93．iZambon，M．andJ．L．Vincent，Mortalityratesforpatientswithacutelunginjury／ARDShavedecreasedovertime．Chest,2008．133(5)：P．1120-7．&FukutoJM，HobbsAJ，IgnarroLJ．Conversionofnitroxyl(HNo)tonitricoxide(NO)inbiologicalsystems：theroleofphysiolo#caloxidantsandrelevancetothebiologicalactivityof．BiochemBiophysResCommun，1993，196：707—713．一Dhainaut，J．F．，RF．Laterre，J．M．Janes，eta1．，Drotrecoginatfa(activated)inthetreatmentofsevereseps&patientswithmultiple-organdysfunction：datafrom纳PPROWESStrial．IntensiveCareMed，2003．29(6)：P．894-903．&Yao，H．W．，L．GMao，andJ．P．Zhu,Protectiveeffectsofpravastatininmurinelipopolysaccharide·inducedacutelunginjury．ClinExpPharmacolPhysiol，2006．33(9)：P，793-7．吼Mukhopadhyay,S．，J．R．Hoidal，andT．K．Muldaerjee，RoleofTNFalphainpulmonarypathophysiology．RespirRes，2006．7：P．125．mGrommes，J．andO．Soehnlein，Contributionofneutrophilstoacutelunginjury．MolMed，2010．nTakahashiT,HatoF,YamaneT,eta1．Activationofhumanneutrophilbycytokine-activatedendothelialcells[J]．circres，2001，88(4)：422-429．挖Rubins，J．B．，Alveolarmacrophages．。wieldingthedouble-edgedswordofinflammation．AmJRespirCritCareMed，2003．167(2)：P．103—4．¨Hwang，Y．EandH．GJeong，Mechanismofphytoestrogenpuerarin—mediatedcytoprotectionfollowingoxidativeinjury：estrogenreceptor-dependentup-regulationofP13K／AktandHO-1．ToxicolApplPharmacol，2008．233(3)：P．371—81．MCherdshewasart，w：andw：Sutjit，Correlationofantioxidantactivityandmajorisoflavonoid27 温州医学院硕士学位论文contentsofthephytoestrogen．richPuerariamirificaandPuerarialobatatubersPhytomedicine，2008．15(1-2)：P．38-43．15．Yu，Z．andW：Li，InductionofapoptosisbypuerarinincoloncancerHT-29cells．CancerLett，2006．238(1)：P．53-60．16．Choi，J．，M．H．Shin，K．Y．Park，eta1．，Effectofkaikasaponin111obtainedfromPuerariathunbergianaflowersonserumandhepaticlipidperoxidesandtissuefactoractivityinthestreptozotocin．induceddiabeticrat．JMedFood，2004．7(1)：P．31—7．17．Miller,S．I．，R．K．Ernst，andM．W．Bader，三飓TLR4andinfectiousdiseasediversity．NatRevMicrobiol，2005．3(1)：P．36—46．18．Miyake，K．，InnateimmunesensingofpathogensanddangersignalsbycellsurfaceToll—likereceptors．SeminImmunol，2007．19(1)：P．3-10．19．LazouAhren，I．，A．Bjartell，A．Egesten，eta1．，Lipopolysaccharide—bindingproteinincreasestoll-likereceptor4-dependentactivationbynontypeableHaemophilusinfluenzae．JInfectDis，2001．184(7)：P．926-30．20．Hensler，T．，S．Sauerland，B。Bouillon，eta1．，Associationbetween蚵urypatternofpatientswithmultipleinjuriesandcirculatinglevelsofsolubletumornecrosisfactorreceptors,interleukin．6andinterleukin一10,andpolymorphonuclearneutrophilelastase．JTrauma,2002．52(5)：P．962-70．21．Giannoudis，EV．，F．Hildebrand，andH．C．Pape，Inflammatoryserummarkersinpatientswithmultipletrauma．Cantheypredictoutcome?JBoneJointSurgBr,2004．86(3)：P．313．23．22．Keel，M．andO．Trentz,Pathophysiologyofpolytrauma．Injury,2005．36(6)：P．691-709．23．Davidson，A．L．andP．C．Maloney，ABCtransporters：howsmaHmachinesdoabigjob．TrendsMierobiol，2007．is(10)：P．448-55．24．Sun，M．andP．J．Fink，Anewclassofreversesignalingcostimulatorsbelongstothe孙伊family．JImmun01．2007．179(7)：P．4307-12．25．Bhati如M．andS．Moochhala，Roleofinflammatorymediatorsinthepathophysiologyofacuterespiratorydistresssyndrome．JPathol，2004．202(2)：P．145-56．26．Ben．Ari，J．，I．R．Makhoul，R．J．Dorio，eta1．，Cytokineresponseduringhyperoxia．"sequentialproductionofpulmonarytumornecrosisfactorandinterleukin一6inneonatalrats．IsrMedAssocJ，2000．2(5)：P．365-9．27．Strieter,R．M．，S．L．Kunkel，andR．C．Bone，Roleoftumornecrosisfactor-alphaindiseasestatesandinflammation．CritCareMed，1993．21(10Suppl)：P．$447—63．28．Strieter,R．M．，S．L．Kunkel，andR．C．Bone，Roleoftumornecrosisfactor-alphaindisease 温州医学院硕士学位论文statesandinflammation．CritCareMed，1993．21(10Suppl)：P．$447-63．29．Knaus，W．A．，TheongoingmysteryofARDS．IntensiveCareMed，1996．22(6)：P．517_8．30．Charo，I．F．andR．M．Ransohoff,Themanyrolesofchemokinesandchemokinereceptorsininflammation．NEnglJMed．2006．354(6)：P．610—21．31．Wolpe，S．D．andA．Cerami，Macrophageinflammatoryproteins．『and2：membersofanovelsuperfamilyofcytokines．FASEBJ，1989．3(14)：P．2565-73．32．Frevert，C．w：，A．Farone，H．Danaee，eta1．，Functionalcharacterizationofratchemokinemacrophageinflammatoryprotein·2．Inflammation，1995．19(1)：P．133—42．33．Kuboki，S．，T．Shin，N．Huber,eta1．，HepatocytesignalingthroughCXCchemokinereceptor-2isdetrimentaltoliverrecoveryafterischemia／reperfusion加mice．Hepatology,2008．48(4)：P．1213-23．34．Gupta,S．，L．Feng，T．Yoshimura,eta1．，Intra—alveolarmacrophage—inflammatorypeptide2inducesrapidneutrophillocalizationinthelung．AmJRespirCellMolBiol，1996．15(5)：P．656-63．35．Quinn，D．A．，R．K．Moufarrej，A．Volokhov,eta1．，Interactionsoflungstretch，hyperoxia,andMIP-2productioninventilator-inducedlunginjury．JApplPhysiol，2002．93(2)：P．517．25．36．Liu，Z．，W．Xu，X。Zhang，eta1．，ExpressionoftheCXCchemokinereceptor3anditsligands加ischemia-reperfusioninjuryofliverinrats．TransplantProc，2008．40(5)：P．1300-2．37．Liu，Y，GSchuller-Levis，andM。R．Quinn，Monocytechemoattractantprotein一_『andmacrophageinflammatoryprotein一2productionisinhibitedbytaurinechloramineinratC6gliomacells．ImmunolLett，1999．70(1)：P．9-14．38．Sen，R．andD．Baltimore，Multiplenuclearfactorsinteractwiththeimmunoglobulinenhancersequences．Cell，1986．46(5)：P．705·16．39．Hilliard，B．，E．B．Samoilova,T．S．Liu，eta1．，ExperimentalautoimmuneencephalomyelitisinNF-kappaB-deficientmice：rolesofNF-kappaBintheactivationanddifferentiationofautoreactiveTcells．JImmunol，1999．163(5)：P．2937-43．40．Liu，S．EandA．B．Malik，NF-kappaBactivationasapathologicalmechanismofsepticshockandinflammation．AmJPhysiolLungCellMolPhysiol，2006．290(4)：P．L622-L645．41．Aghai，Z．H．，S．Kumar,S．Farhath，eta1．，DexamethasonesuppressesexpressionofNuclearFactor-kappaBinthecellsoftracheobronchiallavagefluidinprematureneonateswithrespiratorydistress．PediatrRes，2006．59(6)：P．811-5．42．孙云翔，栗锦迁．葛枳赛扩应箩詹厢及其祝砌砌谚复中草药，2002．33(8)：733—734．43．王永霞，何立人．考提季帮纵：啦萨磊统药翟绣够反柳理叨乡蕾上海中医药杂志2004， 望坐!垦兰堕堡主兰垡笙茎．———————————————————————————————————————————————————————————一。38(4)：62-64．44．黄秀兰，王伟．毒提赛莸动厮嬲薛硬纪律角锄唆搿燃山西中医，2004·20(2)：51_53·45j弋魅晕．葺鼠单．沉蠢。等．葛根素对培养入主动脉内皮细胞脂质过氧化的保护作廷·瓷二军医大学学报，1999，20(4)：240-242． 温州医学院硕士学位论文四、附录个人资料姓名：胡建军性别：男出生年月：1984年8月籍贯：安徽风台简历2000年09月-2003年07月安徽凤台三中2003年09月-2008年07月安徽医科大学2009年09月一至今温州医学院读研期间科研成果：1．葛根素预处理对LPS诱导RAW264．7细胞活化影响。(中国中药杂志9月刊)2．ALI／ARDS与中药治疗。(中国药理学与毒理学杂志)3．改建型STATl．CC基因慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达。(温州医学院学报5月刊) 温州医学院硕士学位论文五、致谢时光飞逝，三年的研究生生活即将划上句号。回首三年求学之路，学习很多，收获很多，而心中的感激更多!首先向我的导师陈成水教授表示衷心的感谢!本研究是在陈老师悉心指导和大力支持下完成的，从课题的立题、设计、实施到论文审改，他都悉心指导，倾注了大量的心血。恩师严谨的治学态度、高尚的医德、精湛的医术、勤勉的工作作风以及谦和的处世态度永远是我学习的榜样!感谢李玉苹主任，您诚恳正直的为人、兢兢业业的工作、活跃的科研思想和临床思维给学生留下了深刻的印象，恩师严谨的科研态度、求实的治学精神是我毕生的追求!感谢王良兴教授、陈少贤教授，非常荣幸得到您们对我实验和临床工作的指导和关心。您们与时俱进、求实创新的精神和淡泊名利的学者胸襟永远是我学习的楷模!感谢呼吸科的所有老师在科研及临床上给予我的指导和关心，感谢师兄杨芳芳，师姐董莉、朱海萍对我细胞实验技术的指导!感谢共同奋斗的张丹丹、陈俊杰、张洁在我实验遇到困难时给予的鼓励和支持!感谢实验过程中曾给予我帮助的每一位朋友!感谢父母和亲人三年来默默的支持和无私的奉献，对他们的感激和爱是无法用语言来表达的，谨以此篇论文献给他们!感谢答辩小组的各位教授，谢谢您们在百忙之中抽出宝贵的时间对我的答辩指导!感谢所有关心和帮助过我的人132 温州医学院硕士学位论文六、综述及参考文献ALI／ARDS与中药治疗急性肺损伤(AcuteLungInjury，ALl)／急性呼吸窘迫综合征(AcuteRespiratoryDistressSyndrome，ARDS)是指各种肺内、外的损伤因素诱发的，以弥漫性肺泡一毛细血管膜损伤所致的肺水肿和肺不张等为病理特征的，临床表现为呼吸窘迫和顽固性低氧血症的常见而严重的临床综合症【1-3】，一直是呼吸和危重病医学界研究的焦点和难点。因该病发病机制复杂，缺乏早期预测的指标及有效的救治措施，导致ALI／ARDS的发病率及病死率极高，严重威胁重症患者的生命并影响其生存质量。ALI／ARDS具有发作快、进展迅猛、预后差的特点，作为一种复杂的综合征，包括炎症反应、氧化应激、凝血．纤溶异常等分子机制均在ALI／ARDS的发病中被证到4卅。因此单一针对某一靶点的治疗策略将难以奏效，而从整体水平深入研究其发病机制，寻找综合性的治疗方法，将成为ALI／ARDS治疗的最终策略。目前针对ALI／ARDS的机械通气辅助疗法及药物治疗均取得了一定的成功。但是尚未从根本上降低ALI／ARDS的病死率，基于ALI／ARDS的发病特点和现今中医药药理学的现代化发展，近来广大学者将如何有效的抑制ALI／ARDS的发病机制与中药联系起来，进行了深入的研究，并取得了极大的成果。为中药针对ALI／ARDS的临床应用提供了理论基础。现将研究进展综述如下。ALI／ARDS的诊断及流行病学自1967年美国科罗拉多大学的呼吸和危重医学家Ashbaugh提出ALI／ARDS概念后，其诊断标准也在不断的完善。虽然ALI／ARDS的诊断存在着因为敏感性差而导致确诊的患者通常已是严重ARDS，本身预后很差以及因特异性不高导致类似血管炎、弥漫性肺泡出血等疾病误诊为ALI／ARDS的情况发生，但是目前ALI的诊断仍然沿用着1994年欧美联席会议上确定的标准：即在排除心源性因素的情况下，患者急性发作(在直接或间接肺损伤后12_48h内发病)、伴有氧合指数小于300(小于200诊断为ARDS)，胸片显示为双侧不均一性的渗出。满足以上四点可确诊。流行病学的统计一直是衡量一个疾病严重程度，以及衡量治疗水平的重要方法，自1994年ALI／ARDS的诊断标准明确后。许多学者都在致力于ALI／ARDS的流行病学研究，GossCH等(7】利用一项前瞻性的队列研究发现ALI／ARDS的发病率每年在4．8．34／100000人之间，并存在着明显的地区性差异。然而RubenfeldGD等峭J对1000名患者长达14个月的跟踪研究发现，ALI／ARDS的发病率每年为78．9／100000人，显示了ALI／ARDS发病率的上升趋势。在我国，以白春学教授等[91开展的对上海市2001．2002年以来入住ICU的年龄超过15岁的患者调查显示， 温州医学院硕士学位论文我国ALI／ARDS的发病率在2％左右，远远高于欧美水平。作为一种严重危害公众健康的疾病，ALI／ARDS的死亡率一直极高，RubenfeldGD等【lo】的统计显示，在美国每年大约有190600位病人发生ALI／ARDS，其中74500位病人死亡，死亡率达到40％左右，而在我国这种死亡率更高，ALI和ARDS的死亡率分别68．5％和70．4％。虽然Zambon等【11J的最新调查表明ALI／ARDS的死亡率在以每年1．1％的比例下降，但目前总的死亡率仍高达43％左右。形势依然十分严峻。此外伴随着ALI／ARDS死亡率的下降，生存下来的患者出院后生理、精神、心里的恢复情况，以及持续性的花费，也是临床工作者需要长期考虑的重点。AngelaM等【12】对117位经ICU治疗后出院的ALI／ARDS病人长达两年前瞻性研究，对他们生存率、身体机能恢复及健康恢复所需的花费进行综合评估后发现，ARDS患者出院后机体的功能仍然处于持续损伤的状态，免疫功能地下，患者多需要多次入院而导致花费的增加，生存质量明显下降。这一结果提示我们及早进行ALI／ARDS患者针对性功能锻炼的重要性。ALI／ARDS的治疗目前ALI／ARDS的治疗主要是在积极治疗原发病的基础上给予机械辅助通气和药物治疗。机械通气是指模拟正常人的呼吸生理变化，借助呼吸机建立气道与肺泡间的压力差，给呼吸功能不全的病人以呼吸支持。机械通气的应用已经成为治疗ALI／ARDS最重要的辅助手段，目前针对ALI／ARDS的机械通气治疗主要包括1：小潮气量通气，作为循证医学中A级的推荐的治疗方法。其降低ALI／AImS的死亡率以得到大家的认可。ARDSnetwork的研究发现【l31，给予低潮气量(6ml／kg体重)辅以高PEEP治疗下，ARDS的死亡率由40％下降到了31％；2：呼气末正压通气，通过建立呼气末的正压环境防止肺泡的萎陷；3：肺复张策略，应用高PEEP、高频通气及间断大潮气量通气等方法进行肺开放治疗，明显改善ALI患者氧合作用，但是对于重症ARDS患者以及合并器官功能不全的患者，此种方法需谨慎【141；4：俯卧位通气，通过改变通气／灌注比例改善患者的呼吸衰竭状态，RialpG等【15】发现经仰卧位通气效果不佳的ARDS患者改用俯卧位通气后，其氧合作用改善明显；5，其他方式如气管内吹气(TGI)及死腔内气体吸出技术(ASPIDS)，通过促进生理无效腔内的气体置换改善ALI／ARDS患者的氧合作用，尤其适用于辅助小潮气量通气的患者。随着ALI／ARDS发病机制研究的深入，针对ALI／ARDS治疗的一系列药物如吸人性一氧化氮(inhalednitricoxide，NO)舒张肺血管，改善肺通气．血流比例的作用、肺泡表面活性物质(pulmonarysurfacent，PS)改善于肺的顺应性及预防肺水肿的作用、糖皮质激素的抗炎作用、活性蛋白C(activatedproteinC，APC)调节凝血纤溶失衡的作用[16-19J以明确，并取得了一定的效果。但是需要明确的是，ALI／ARDS的主要死因不是呼吸衰竭，而是败血症相关 温州医学院硕士学位论文的多器官功能衰竭【2们，因此主要针对呼吸支持的机械通气改善死亡率的效果不明显，并且由于患者肺部的损伤导致机械通气后极易出现呼吸机相关肺炎的产生[21】，加重病情。此外虽然各种抗ALI／ARDS的药物在不停的研发中，但是至今没有循证医学推荐的药物出现。并且各种药物对于改善ALI／ARDS患者的生存率方面仍证据不足【22】。因此结合我国对中医药研究的优势，以及中医药在对抗SIRS等疾病中已经取得成果。以及中药调节人体机能的特点。中西医结合防治ALI／ARDS的策略变的尤为重要。中药的抗炎机制与ALI／ARDS近年来随着失控的炎症反应引发ALI／ARDS这一中心机制被广泛接受，参与炎症反应的炎症细胞和细胞因子及其可能的信号转导途径成为了研究的热点。炎症是机体应对感染及非感染因素侵犯后，为了维持内环境的稳定，而产生的高度有组织化的应答，一般包括一下几个过程，即受刺激组织的防御反应、急性时相反应、疾病特定症状和行为学的出现、痛觉的发生以及下丘脑．垂体-肾上腺轴的应激反应【2324]。组织的防御反应可以通过炎症反应破坏、稀释和包含有害物质从而修复损伤的组织。但是这种防御的反应如果过度就会导致严重的后果，在肺部的恶性结果就表现为ALI／ARDS(图1)。因此如何抑制这种过度的炎症反应，使组织的防御反应恢复到适度的范围成为了治疗ALIlARDS的课题。图1ALI／ARDS时肺泡内的过度炎症反应【25】中性粒细胞、巨噬细胞、内皮细胞等多种细胞与TNF．a、IL．1、IL．8、IL．10 温州医学院硕士学位论文等多种细胞因子通过包括NF．1出在内的多种通路相互作用，相互激发贯穿在ALI／ARDS发生、发展的全过程。徐防等【26】研究发现，在用姜黄素干预油酸导致的大鼠ARDS模型后，大鼠肺脏的病理生理变化明细减轻，同时大鼠肺泡灌洗液(BALF)中的TNF．a和IL．6下降，且与肺脏内NF．迎下降存在着时一效关系，推测姜黄素通过阻断NF．迎通路达到抑制炎症反应的效果。而胡孔友127j的研究发现，凉膈散通过促进抗炎介质IL．10的表达来抑制炎症介质的释放，从而调节促炎和抗炎反应的动态平衡，对ALI产生保护效应。在对氧化苦参碱(OMT)的研究中，吕伟等【28】发现在大鼠盲肠结扎穿孔诱发ALI后，OMT的灌胃治疗可明显降低肺部的病理生理变化，增加肺的顺应性。而这种改变是通过抑$1]Janus激酶．信号转导转录激活因子(Januskinase-signaltransductionandtranscriptionactivator,JAK．STAT)Jm_路实现的I刀J。做为诱导ALI／ARDS模型最经典的方式，脂多糖(LPS)的应用已被广泛应用。张骅【30】探讨了虎杖对LPS诱导大鼠ALI的保护作用中发现，ALI在不同时间点的病理生理变化与血清TNF．a、IL．6等的水平密切相关，而虎杖正是通过抑制这些因子的释放达到减轻肺部病理损伤的目的。汤彦等【3l】研究中药辅助机械通气在ALI／ARDS治疗中的潜在可能性，他们发现与单纯使用机械通气相比，ICU的病人在联合大黄(鼻饲60egdq8h)治疗后，其脱机时间明显缩短，脱机成功率明显增加，提示大黄联合治疗ALUARDS的可行性。复方合剂一直是中药治疗中的重要部分，李玉梅等【3233]发现，由大黄、厚朴、枳实、芒硝组成的大承气汤具有比地塞米松更强的抑制炎症因子释放的作用，并且可以增加抗炎因子IL．10的显著增加，从而调节肺部促炎介质．抗炎介质的平衡。而苏景深【34】对泻肺法、通腑法、通腑泻肺法的研究发现，三种复方合剂可以通过不同的机制抑制炎症因子的释放对油酸诱导的Wistar大鼠ALI／ARDS产生保护作用。中药对抗氧化应激与ALI／ARDS氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)和活性氮自由基(reactivenitrogenspecies，RNS)过度表达，氧化能力超出氧化清除剂的清除能力，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤和死亡。参与氧化损伤的物质主要包括ROS和RNS两大类【3536‘，氧气的正常代谢产生-了ROS[，73引，这种正常ROS产生过程在包括细胞呼吸以及炎症防御过程中具有重要的意义。RNS主要包括NO和过氧亚硝酸盐(由NO和超氧阴离子反应生成，具有极高的反应活性和结构不稳定性，以及LP,NO更高的细胞毒性)。研究发现过氧亚硝酸盐可触发多种的炎症因子释放L匕!tNICAM．1，P．选择素，IL-8，NF．KB等【39】。此外过氧亚硝酸盐可介导硝基化反应，破坏蛋白和脂质，抑制线粒体酶，消耗谷胱甘肽，破坏DNA链【40】。在氧化损伤中扮演重要的角色。 温州医学院硕士学位论文研究发现在ALI／ARDS中氧化剂和抗氧化剂平衡的破坏是一种重要的机制【411。Bowler[421发现ALI病人气道末端的水溶性抗氧化剂谷胱甘肽，维生素C以及尿酸盐的水平明显下降。而在ALI病人呼出的气体冷凝物中Sznajerl4列及Carpenterl44】发现过氧化氢以及代表细胞膜磷脂过氧化的异前列腺素浓度却明显的升高。此夕[,Kumar[45】究发现已发生ARDS的病人比仅存在ARDS发生风险的病人的脂质氧化产物多，同时二者不饱和脂肪酸都明显下降。郝嘉等146]发现经氧自由基作用的大鼠血浆中丙二醛的量及NO的含量明显升高，而经黄芪治疗后，大鼠在不同的时间点的丙二醛及NO的含量均明显下降，表明黄芪可以有效的抑制氧自由基导致的大鼠损伤。胡亚娥等147]对氧化苦参碱研究也发现了其可以通过抑制诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达，降低巨噬细胞中NO的产生与释放，达到抗氧化的目的。而杨胜兰等【48j对复合方剂大承气汤的研究也发现了其抑制丙二醛产生，降低肺水肿的作用。提示大承气汤参与了抗氧化作用。除了以抗炎、抗氧化作用参与到ALI／AI①S的治疗中，中药还在其他方面扮演着重要的作用，我们知道ALI／ARDS发生的一个重要的机制是凝血．纤溶机制的异常，因此活血化瘀类的中药在ALI／ARDS的作用日益明显【49J，同时谷建钟等【50J对大承气汤的进一步研究发现，相对于油酸导致的ARDS大鼠，大承气汤灌胃处理7日后的ARDS大鼠，其血小板及凝血系统发生明显改变，肺部的微血栓明显减少，ARDS大鼠的肺部病理生理变化明显减轻，提示大承气汤可通过影响大鼠的凝血．纤溶系统。综上所述，ALI／ARDS的治疗仍然是困扰着临床工作者一大难题，随着对其发病机制的进一步研究，以及我国在中药研发上的努力及巨大优势。中西医结合诊治ALI／AImS将具有极大的优势，必将推动ALI／AImS治疗方面的巨大进步。 温州医学院硕士学位论文参考文献LAshbaugh，D．G，D．B．Bigelow,T．L．Petty,eta1．，Acuterespiratorydistressinadults．Lancet，1967．2(7511)：P．319—23．ZBernard，GR．，A．Artigas，K．L．Brigham，eta1．，TheAmerican-EuropeanConsensusConferenceonARDS．Definitions,mechanisms,relevantoutcomes，andclinicaltrialcoordination．AmJRespirCritCareMed,1994．149(3Pt1)：P．818—24．王Ware，L．B．andM．A．Matthay,Theacuterespiratorydistresssyndrome．NEnglJMed，2000．342(18)：P．1334-49．乱FukutoJM，HobbsAJ，IgnarroLJ．Conversionofnitroxyl(HNo)tonitricoxide(NO)inbiologicalsystems：theroleofphysiologicaloxidan括andrelevancetothebiologicalactivityoftaro．BiochemBiophysResCommun，1993，196：707—1713．iDhainaut，J．F．，P．F．Laterre，J．M．Janes，eta1．，Drotrecoginatfa(activated)inthetreatmentofseveresepsispatientswithmultiple—organdysfunction：datafromthePROWESStrial．IntensiveCareMed，2003．29(6)：P．894-903．&Yao，H．W：，L．GMao，andJ．P．Zhu，Protectiveeffectsofpravastatininmurinelipopolysaccharide-inducedacutelunginjury．ClinExpPharmacolPhysiol，2006．33(9)：P．793．7．ZGoss，C．H．，R．CtBrower,L．D．Hudson,eta1．，IncidenceofacutelunginjuryintheUnitedStates．CritCareMed，2003．31(6)：P．1607-11．&Rubenfeld，G．D．，eta1．，Incidenceandoutcomesofacutelunginjury．NEnglJMed，2005．353(16)：P．1685—93．殳Lu，Y，Z．Song，X．Zhou，eta1．，A12-monthclinicalsurveyofincidenceandoutcomeofacuterespiratorydistresssyndromeinShanghaiintensivecareunits．IntensiveCareMed，2004．30(12)：P．2197-203．mRubenfeld，GD．andM．S．Herridge，Epidemiologyandoutcomesofacutelunginjury．Chest，2007．131(2)：P．554-62．UZambon，M．andJ．L．Vincent，Mortalityratesforpatientswithacutelungi玎0ury／ARDShavedecreasedovertime．Chest，2008．133(5)：P．1120-7．坦Cheung，A．M．，C．M．Tansey,GTomlinson，eta1．，Two-yearoutcomes,heaRhcareuse，andcostsofsurvivorsofacuterespiratorydistresssyndrome．AmJRespirCritCareMed，2006．174(5)：P．538—44．BOba,YandCLA．Salzman，Ventilationwithlowertidalvolumesascomparedwithtraditionaltidalvolumesfo，．acutelunginjury．NEnglJMed．2000．343(11)：P．813；authorreplyR13—438 14．ValenteBarbas，C．S．，Lungrecruitmentmaneuversinacuterespiratorydistresssyndromeandfacilitatingresolution．CritCareMed，2003．31(4Suppl)：P．$265-71·15．DeRobertis，E．，GServillo，R．Tufano，eta1．，Aspirationofdeadspaceallowsisocapniclowtidalvolumeventilationinacutelunginjury．Relationshipstogasexchangeandmechanics．IntensiveCareMed，2001．27(9)：P．1496-503．16．Sokol，J．，S．E．Jacobs，andD．Bohn，Inhalednitricoxidefo，．acutehypoxicrespiratoryfailureinchildrenandadults．"ameta-analysis．AnesthAnalg，2003．97(4)：P．989-98．17．Spragg，R．G，J．F．Lewis，H．D．Walmrath，eta1．，EffectofrecombinantsurfactantproteinC-basedsurfactantontheacuterespiratorydistresssyndrome，NEnglJMed，2004．351(9)：P．884-92．18．Steinberg，K．E，L．D．Hudson，R．B．Goodman，eta1．，Efficacyandsafetyofcorticosteroids加rpersistentacuterespiratorydistresssyndrome．NEngl】Med，2006．354(16)：P．1671-84．19．Bernard，G．R．，J．L．Vincent，EF．Laterre，eta1．，EfficacyandsafetyofrecombinanthumanactivatedproteinCfo，severesepsis．NEnglJMed，2001．344(10)：P．699-709．20．Estenssoro，E．，A．Dubin，E．Laffaire，eta1．，Incidence，clinicalcourse,andoutcomein217patientswithacuterespiratorydistresssyndrome．CritCareMed，2002．30(11)：P．2450-6．21．Gajic，O．，s．I．Dara,J．L．Mendez，eta1．，Ventilator-associatedlunginjuryinpatientswithoutacutelunginjuryattheonsetofmechanicalventilation．CritCareMed，2004．32(9)：P．1817-24．22．Cepkova’M．andM．A．Matthay,Pharmacotherapyofacutelunginjuryandtheacuterespiratorydistresssyndrome．JIntensiveCareMed，2006．21(3)：P．119-43．23．Meduri，GU．，TheroleofthehostdefenceresponseintheprogressionandoutcomeofARDS：pathophysiologicalcorrelationsandresponsetoglucocorticoidtreatment．EurRespirJ，1996．9(12)：P．2650·70．24．Dantzer,R．andK．W：Kelley,Twentyyearsofresearchoncytokine—inducedsicknessbehaviorBrainBehavImmun，2007．21(2)：P．153—60．25．Ware，L．B．andM．A．Matthay,Theacuterespiratorydistresssyndrome．NEnglJMed，2000．342(18)：P．1334—49．26．徐唠，弛丹凰发舂．姜黄素干预油酸诱导的ALl／ARDs大鼠模型对NF-xB、TNF-a和IL．6的影张生命科学研究，2011．15(1)．∞．胬襟苏。凉瞩散对内毒素致大鼠急性秭损伤的保护作甬及其炎症调控祝翻．2009．橇．黾谦。氧化苦参碱对急性静损伤的保护作用研氪2006．29．张鸣号，李桂忠曹军，霸纪考参磁影舫毒症六魔彩绍豸晕JAK／STAT苈号遵路的影张中39 国中药杂志，2010(01)：P．103·107．30．张骅，刘琨，张民，等，磨秘形镑多劳雳导天鼠意丝彩拐笏的糟厅绍用中国老年学杂志，2009．29(2)：P．146-149．31．汤彦，田金飞，周心涛，等，六苛群畲祝磁I嬗岢戏艚念雒妒吸窘遁综兮征职业与健康，2008．24(19)：P．2112-13．32．李玉梅，卫洪昌汪东颖，久．承气历艚疗：六厨力毒煮幽肋S崩疗破乞铲撕及兔度堀筇扣蒯谚窟中国病理生理杂志，2009．25(10)：P．2027-32．33．李玉梅，卫洪昌吴中华，夕∈=季气彦历影急丝舻删综合征才鼠笳溶巨磋纫膳NF-xB厝丝及箕炎丝纫彪团子麦迭馓影璩中华急诊医学杂志，2009．18(11)：P．1173-77．34．苏景深，孙增涛，刘恩顺，等，不甸糟堪夥4三删RDs力魔炎丝相关因子络劈厅蟛镌第十一次全国中西医结合防治呼吸系统疾病学术研讨会论文集．2010．35．Nathan，C．，Specificityofathirdkind：reactiveoxygenandnitrogenintermediatesincellsignaling．JClinInvest．2003．111(6)：P．769-78．36．Marnett，L．J．，J．N．Riggins，andJ．D．West，Endogenousgenera“onofreactiveoxidantsandelectrophilesandtheirreactionswithDNAandprotein．JClinInvest，2003．111(5)：P．583．93．37．Gutteridge，J．M．andJ．Mitchell，Redoximbalanceinthecriticallyi11．BrMedBull，1999．55(1)：P．49-75．38．Frei，B．，Reactiveoxygenspeciesandantioxidantvitamins：mechanismsofac玎on．AmJMed，1994．97(3A)：P．5S-13S；discussion22S-28S．39．Szabo，C．，Multiplepathwaysofperoxynitritecytotoxicity．ToxicolLett，2003．140—141：P．105．12．40．Virag，L．，E．Szabo，EGergely,eta1．，Peroxynitrite—inducedcytotoxicityjmechan如mandopportunitiesfo，．intervention．ToxicolLett．2003．140-141：P．113-24．41．Lang，J．D．，EJ．McArdle，P．J．O’Reilly,eta1．，Oxidant—antioxidantbalanceinacumlunginjury．Chest，2002．122(6Suppl)：P．314S-320S．42．Bowler,R．P．，L．w：Velsor,B．Duda,eta1．，Pulmonaryedemafluidantioxidantsaredepressedin∞“胞lunginjury．CritCareMed，2003．3l(9)：P．2309—15．43．Sznajder,J．I．；Fraiman，A．；Hall，J．B．；eta1．，Increasedhydrogenperoxideintheexpiredbreathofpatientswithacutehypoxemicrespiratoryfailure．Chest，1989．96：606-612．44．Carpenter,C．T．，EV．Price，andB．W：Christman，Exhaledbreathcondensate括oprostanesareelevatedinpatientswithacutelunginjuryorARDS．Chest,1998．114(6)：P．1653-9．45．Kumar,K．V，S．M．Rao，R．Gayani，eta1．，Oxidantstressandessentialfattyacidsinpatients 里丛垦兰堕堡主堂垡笙塞——_—————————————————————————————————————————————————————————————————————一withriskandestablishedARDS．ClinChimActa,2000．298(1-2)：P．111-20．46．郝嘉，肖颖彬，钟前进，等，赏蓖黟氧自虏墓颈笏拐笏的织护绺用现代中西医结合杂志，2004．13(5)：P．578-579．47．胡亚娥，茅家慧，刘霞，等，氧纪考参旅豺绉多帮谚导94w264．7纫施_氧纪氯及菇雳导型台艨蓑送馓影碱南通大学学报(医学版)，2011．31(3)．48．杨胜兰，王鹏，丈承气历动肠游丝彩贺苈天鼠嬲绣抗氧纪锯护缮劈彩研究湖北中医学院学报，2003．5(3)：P．21—22．49．王建彬杨宇飞，活血纪癜尹药防游威彩丝黝孑笏的砑挠龋医学研究杂志，2008．37(12)：P．115-118．sQ．谷建钟．时普。张与爱等．大承气汤对急性呼吸窘迫综合征大鼠血小板及凝血系统的作用浙江中医学院学报，2006．30(1)：P．78—79．41