芍药苷对lps诱导的raw264.7细胞hmgb1表达的影响

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1、芍药苷对LPS诱导的RAW264.7细胞HMGB1表达的影响常蕴青赵中夫刘明社【摘要】目的：观察芍药苷对脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核/巨噬细胞株(RAGB1）释放和表达的影响。方法：体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞培养三代后，转种于放置了无菌处理盖玻片的6孔培养板中，将细胞分为对照组、LPS刺激组（100ng/mL）、芍药苷组（LPS100ng/mL＋芍药苷0.625mg/mL）；LPS刺激20h后，免疫细胞化学法检测各组培养细胞HMGB1的表达水平。结果：LPS刺激RAGB1特异性染色变淡，胞浆染色加深，表明HMGB1从胞核转移到胞浆;芍药苷组大部分细胞

2、核HMGB1特异性染色深，而胞浆染色浅，表明芍药苷抑制HMGB1从胞核转移到胞浆。对HMGB1免疫组化数字图像的累积光密度值分析显示，HMGB1含量在三个实验组间差异有统计学意义（F=918.67，P0.01），LPS刺激组和芍药苷组间差异有统计学意义（q=22.66,P0.01）。结论：芍药苷可能通过抑制HMGB1的核转位和释放，对LPS诱导的肝损伤起保护作用。【关键词】芍药苷；脂多糖；小鼠腹腔巨噬细胞；高迁移率族蛋白B1AbstractObjective：Toinvestigatetheeffectsofpaeoniflorinontheexpre

3、ssionofhighmobilitygroupbox1(HMGB1)inRAethods:RAacrophagesLLPStreatmentgroupand0.625mg/mLpaeoniflorintreatmentgroup.After20htreatment,theexpressionofHMGB1easuredbyimmunohistochemicalmethod.Results:At20hafterRAGB1.Keyacrophages;Highmobilitygroupbox1(HMGB1)芍药苷(paeoniflorin，Pae)为一种

4、蒎烷单萜苷，主要存在于毛莨科植物芍药（PaeonialactifloraPall）的根皮部，以中药赤芍中含量最高，毒性极低，具有镇静、解痉、抗炎、免疫调节和保肝等作用〔１〕。本实验拟通过脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激小鼠巨噬细胞系建立炎症细胞模型，观察芍药苷对LPS诱导的RAGB1表达的影响，以探讨芍药苷对其是否具有保护作用，进而深入了解芍药苷抗炎作用机制，为进一步研究开发防治肝病的药物提供理论依据。1材料与方法1.1主要试剂芍药苷：南京替斯艾么中药研究所；小鼠单核/巨噬细胞株(RAGB1抗体：英国Abcam公司；新生牛血清

5、（FCS）：杭州四季青公司产品；RPMI-1640：美国Gibco公司；胰蛋白酶：美国Sigma公司；EDTA：华美生物工程公司；UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒：福州迈新公司；Tritonx-100：北京中山试剂公司；LPS：美国Sigma公司。1.2实验方法1.2.1.RAI-1640培养液中培养。为防止LPS干扰，培养基中加入了10μg/mL的多粘菌素B。37℃、5％CO2孵箱中培养，待细胞融合80％后，以0.25％胰蛋白酶＋1mmol/LEDTA溶液消化传代。1.2.2细胞活性鉴定：台盼蓝拒染实验：将刺激后的细胞用EDTA消化后吹

6、打成单细胞悬液，取0.5mL0.4%的台盼蓝染液、0.3mLHBSS和0.2mL细胞悬液，充分混匀。用毛细吸管吸取少量混合液，注入血细胞计数板小室，计数其中着色的细胞。细胞活力=(总细胞数-着色细胞数)/总细胞数×100%1.2.3.芍药苷抑制LPS诱导RAGB1释放的免疫组化实验：将培养板作好标志分别为A板、B板、C板，每组设三个复孔。正常对照组（A1-A6）：培养液1mL；LPS组（B1-B6）：培养液+LPS100ng/mL；芍药苷组(C1-C6)：培养液+LPS100ng/mL+Pae0.625mg/mL。各孔细胞在受LPS刺激前先换成无血清的

7、RPMI-1640培养液，孵育2h后以相应剂量的LPS刺激，均于刺激20h后，小心取出培养孔内载玻片，进行免疫组化实验。弃去培养液，PBS洗2次；4％的多聚甲醛固定15min,PBS洗3次，每次3min;每张切片加一滴H2O2阻断剂溶液，室温孵育10min，PBS洗3次，每次3min;每张切片加一滴非免疫动物血清，室温孵育10min;加入含0.3％Tritonx-100的PBS，37℃孵育30min，PBS洗3次，每次3min;除阴性对照孔外，每张切片加一滴1∶250稀释的抗体，4℃过夜;次日晨，从冰箱取出，室温下30min,PBS洗3次，每次3min

8、;每张切片加一滴生物素标记的二抗，室温孵育10min，PBS洗3次，每次3min;每张切片加一