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时间:2018-05-07
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1、芍药苷对LPS诱导的RAW264.7细胞HMGB1表达的影响常蕴青赵中夫刘明社【摘要】目的:观察芍药苷对脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核/巨噬细胞株(RAGB1)释放和表达的影响。方法:体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞培养三代后,转种于放置了无菌处理盖玻片的6孔培养板中,将细胞分为对照组、LPS刺激组(100ng/mL)、芍药苷组(LPS100ng/mL+芍药苷0.625mg/mL);LPS刺激20h后,免疫细胞化学法检测各组培养细胞HMGB1的表达水平。结果:LPS刺激RAGB1特异性染色变淡,胞浆染色加深,表明HMGB1从胞核转移到胞浆;芍药苷组大部分细胞
2、核HMGB1特异性染色深,而胞浆染色浅,表明芍药苷抑制HMGB1从胞核转移到胞浆。对HMGB1免疫组化数字图像的累积光密度值分析显示,HMGB1含量在三个实验组间差异有统计学意义(F=918.67,P0.01),LPS刺激组和芍药苷组间差异有统计学意义(q=22.66,P0.01)。结论:芍药苷可能通过抑制HMGB1的核转位和释放,对LPS诱导的肝损伤起保护作用。【关键词】芍药苷;脂多糖;小鼠腹腔巨噬细胞;高迁移率族蛋白B1AbstractObjective:Toinvestigatetheeffectsofpaeoniflorinontheexpre
3、ssionofhighmobilitygroupbox1(HMGB1)inRAethods:RAacrophagesLLPStreatmentgroupand0.625mg/mLpaeoniflorintreatmentgroup.After20htreatment,theexpressionofHMGB1easuredbyimmunohistochemicalmethod.Results:At20hafterRAGB1.Keyacrophages;Highmobilitygroupbox1(HMGB1)芍药苷(paeoniflorin,Pae)为一种
4、蒎烷单萜苷,主要存在于毛莨科植物芍药(PaeonialactifloraPall)的根皮部,以中药赤芍中含量最高,毒性极低,具有镇静、解痉、抗炎、免疫调节和保肝等作用〔1〕。本实验拟通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠巨噬细胞系建立炎症细胞模型,观察芍药苷对LPS诱导的RAGB1表达的影响,以探讨芍药苷对其是否具有保护作用,进而深入了解芍药苷抗炎作用机制,为进一步研究开发防治肝病的药物提供理论依据。1材料与方法1.1主要试剂芍药苷:南京替斯艾么中药研究所;小鼠单核/巨噬细胞株(RAGB1抗体:英国Abcam公司;新生牛血清
5、(FCS):杭州四季青公司产品;RPMI-1640:美国Gibco公司;胰蛋白酶:美国Sigma公司;EDTA:华美生物工程公司;UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒:福州迈新公司;Tritonx-100:北京中山试剂公司;LPS:美国Sigma公司。1.2实验方法1.2.1.RAI-1640培养液中培养。为防止LPS干扰,培养基中加入了10μg/mL的多粘菌素B。37℃、5%CO2孵箱中培养,待细胞融合80%后,以0.25%胰蛋白酶+1mmol/LEDTA溶液消化传代。1.2.2细胞活性鉴定:台盼蓝拒染实验:将刺激后的细胞用EDTA消化后吹
6、打成单细胞悬液,取0.5mL0.4%的台盼蓝染液、0.3mLHBSS和0.2mL细胞悬液,充分混匀。用毛细吸管吸取少量混合液,注入血细胞计数板小室,计数其中着色的细胞。细胞活力=(总细胞数-着色细胞数)/总细胞数×100%1.2.3.芍药苷抑制LPS诱导RAGB1释放的免疫组化实验:将培养板作好标志分别为A板、B板、C板,每组设三个复孔。正常对照组(A1-A6):培养液1mL;LPS组(B1-B6):培养液+LPS100ng/mL;芍药苷组(C1-C6):培养液+LPS100ng/mL+Pae0.625mg/mL。各孔细胞在受LPS刺激前先换成无血清的
7、RPMI-1640培养液,孵育2h后以相应剂量的LPS刺激,均于刺激20h后,小心取出培养孔内载玻片,进行免疫组化实验。弃去培养液,PBS洗2次;4%的多聚甲醛固定15min,PBS洗3次,每次3min;每张切片加一滴H2O2阻断剂溶液,室温孵育10min,PBS洗3次,每次3min;每张切片加一滴非免疫动物血清,室温孵育10min;加入含0.3%Tritonx-100的PBS,37℃孵育30min,PBS洗3次,每次3min;除阴性对照孔外,每张切片加一滴1∶250稀释的抗体,4℃过夜;次日晨,从冰箱取出,室温下30min,PBS洗3次,每次3min
8、;每张切片加一滴生物素标记的二抗,室温孵育10min,PBS洗3次,每次3min;每张切片加一
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