lps诱导raw264.7细胞内hmgb1转位及释放实验研究

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1、LPS诱导RAW264.7细胞内HMGB1转位及释放实验研究【摘要】目的：观察LPS诱导RAW264.7细胞内HMGB1转位及其释放。方法：用不同浓度的LPS处理小鼠RAW264.7细胞20h，用荧光显微镜观察LPS诱导RAW264.7细胞HMGB1的分布情况。用Westernblot方法检测HMGB1在胞核及培养上清中的水平。结果：LPS处理小鼠RAW264.7细胞20h后，培养上清中的HMGB1水平明显增加，胞核HMGB1含量减少，并存在剂量依赖关系。结论：LPS能诱导RAW264.7细胞释放HMGB1，存在剂量依赖关系。【关键

2、词】LPSRAW264.7细胞HMGB1转位和释放AbstractObjective：ThepurposeofthisstudywastoinvestigatethetranslocationandreleaseofHMGB1inLPS-inducedRAW264.7cell.Methods:RAW264.7cellswereincubatedwithdifferentconcentrationsLPSfor20hours,thedistributionandlevelsofHMGB1inRAW264.7cellsweresubse

3、quentlyanalyzedbyimmunofluorenceandWesternblot,respectively.Results:HMGB1accumulationintheculturemediaofLPS-inducedRAW264.7cellswassignificantlyincreased,andtheaccumulationofHMGB1inthenucleuswasremarkablyreduced.Conclusion:LPScaninducesignificantreleaseofHMGB17inRAW264

4、.7cellsinadose-dependentmanner.KeywordsLPS;RAW264.7cells;HMGB1Translocationandrelease以往研究表明，内毒素可刺激TNF-α、IL-1等早期细胞因子的合成和释放，被认为是动物多器官功能损害和死亡的核心因子。但抗TNF-α抗体治疗脓毒症的临床研究并未取得预期效果。新近研究发现，巨噬细胞可以产生一种新的细胞因子—高迁移率组蛋白B1（highmobilitygroupbox-1protein，HMGB1）。该细胞因子具有释放晚、持续时间长的特点，被认为是引发

5、机体炎症级联反应的重要介质。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性杆菌的主要致病成份，本实验重点探讨LPS对RAW264.7细胞内HMGB1转位及其释放的影响。1材料与方法1.1材料RAW264.7细胞由上海细胞生物所细胞库提供；RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；新生牛血清购自杭州四季青生物制品公司；荧光免疫分析试剂盒购自苏州新波生物技术有限公司。71.2.RAW264.7细胞的培养复苏后的RAW264.7细胞置于含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、10%新生牛血清、2mol/L谷氨

6、酰胺的RPMI1640培养液中培养。37℃5%CO2孵箱培养，待细胞铺满80%后以0.25%酶、0.02%EDTA消化，传代培养4次以后（达对数生长期）调整细胞浓度为4×105/L（用于免疫荧光）或4×106/L（用于提取蛋白质），转种于放置了无菌处理盖玻片的6孔细胞培养板中，置37℃5%CO2孵箱培养，细胞单层融合达80%后，换无血清的RPMI1640培养液，孵育2h用于实验。1.3.LPS诱导RAW264.7细胞HMGB1转位实验以50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、250ng/mL500ng/mL不同剂量的LP

7、S刺激，均于刺激20h后，取出培养孔内载玻片，进行免疫荧光实验，显微镜下观察并拍照。1.4细胞活性鉴定台盼蓝拒染实验：将刺激后的细胞用EDTA消化后吹打成单细胞悬液，取0.5mL0.4%的台盼蓝染液、0.3mLHBSS和0.2mL细胞悬液，充分混匀。用毛细吸管吸取少量混合液，注入血细胞计数板小室，计数其中着色的细胞。71.5.HMGB1蛋白的表达测定Westernblot方法测定：上样量为30μg将待测样品与一倍量上样缓冲液混匀，封口，放在微量加热器中95℃加热5min后，放置于冰上直至加样。各样品在15%的聚丙稀酰胺凝胶中电泳，并

8、电转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭过夜后，加入1∶1000稀释的小鼠抗人的HMGB1单克隆抗体，4℃过夜，TBS洗膜后，加入1∶1000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体，室温孵育2h，TBS洗膜后，BCIP/NBT显色，当特异性