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1、五灵胶囊对LPS诱导枯否细胞释放细胞因子的影响论文王胜春，张英志，胡咏武，李晓玮，田卫斌【关键词】,五灵胶囊【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectsofETHODS:HepatocyteandKupffer’scellsratliversandthenexposedtoLPSandDGlan.ThechangesofhepatocytesandcytokinessecretedfromKupffer’scellsinedinthepresenceofEMF12培养基（批号：1095578，USA.Gibco公司）；新生牛血清（NBS）（杭州四季青
2、，批号：200206112，用前灭活56℃，30min）；脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）(USA.Sigma公司)；丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotransferase，ALT）、乳酸脱氢酶（Lactatedehydrogenase，LDHL）试剂盒（北京中生北控生物科技股份有限公司）；单胺氧化酶（monoamineoxidase，MAO）、丙二醛（maleicdialdehyde，MDA）、谷胱甘肽S转移酶（glutathionestransferase，GSHST）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；肿瘤坏死因子α（tumornecrosis
3、factor，TNFα）、白细胞介素6（interleukin6，IL6）、白细胞介素8（interleukin8,IL8）试剂盒（北京北方生物技术研究所）；RaabitantiCD14，RaabitantiTNFα（武汉博士德生物工程有限公司）；五灵胶囊（西京医院制剂室生产，批号：20020207）；1252型紫外分光光度计（日本岛津）；BB16/贺利气体培养箱（德国HERAEUS公司）.1.2方法1.2.1供试液的制备1640维持液：取灭活小牛血清10mL加RPMI164090mL，即得；1640生长液：取灭活小牛血清20mL加RPMI164080mL，即得；DMEM维持液：
4、取灭活小牛血清10mL加DMEMF1290mL，即得；DMEM生长液：取灭活小牛血清20mL加DMEMF1280mL，即得；LPS贮备液：精密称取LPS1.0mg，加1640DMEM维持液溶解至10mL，微孔滤膜除菌，-20℃冷藏，备用；20μg/LLPS供试液：取LPS贮备液加DMEM维持液稀释至20μg/L，临用现配；60μg/LLPS供试液：取LPS贮备液加混合液（肝细胞培养上清和1640维持液1∶1混合）稀释至60μg/L，临用现配；0.5mmol/LDGlaN供试液：精密称取DGlaN5.38mg，加DMEM维持液10mL，微孔滤膜除菌，-20℃冷藏，用时加DMEM维持
5、液稀释至50mL；五灵胶囊供试液：取五灵胶囊内容物20g，加乙醇150mL回流提取1h，滤过，减压回收乙醇，残渣加DMSO溶解制成1.0kg/L（以药粉计）的贮备液，微孔滤膜除菌过滤（0.22~0.45μm），用时取1.0kg/L的贮备液加DMEM维持液稀释至终浓度为（4,3,2g/L）为肝细胞受试药物；另取1g/L的贮备液加1640维持液稀释至终浓度为（0.2,0.1g/L）为KC细胞受试药物.1.2.2大鼠原代肝细胞分离与药效试验取12L麻醉(250mg/L,ip)，按文献［4］操作制备原代肝细胞，肝细胞重悬于DMEM生长液中，调整细胞密度为2×108个细胞/L，接种于24孔
6、培养板内，置37℃50mL/LCO2孵箱内培养48h后，吸弃培养液；加4，2g/L浓度五灵胶囊与肝细胞培养32h,台盼蓝拒染试验和MTT活性试验检测受试药物对细胞毒性的影响,.freel0.550～0.650，进行试验.①肝细胞修复试验：取培养板内细胞分为：正常组、DGlaN（或LPS）,五灵胶囊4,3和2g/L组，正常组每孔加DMEM维持液；DGlaN,LPS2种损伤组与五灵胶囊3个剂量组分别加0.5mmol/LDGlaN,20μg/LLPS供试液培养24h，每组每剂量，1mL/孔(n=8)，吸弃培养上清；正常组、DGlaN与LPS2种损伤组加DMEM维持液，五灵胶囊3个剂量组
7、加相应的剂量供试液1mL/孔，继续培养24h，收集培养上清，测定ALT,MAO,LDHL,GSHST和MDA;②肝细胞保护试验：另取肝细胞置24孔板内培养、分组同上，正常组和DGlaN,LPS损伤组加DMEM维持液1mL/孔，五灵胶囊3个剂量组加相应剂量供试液1mL/孔，培养24h，吸弃上清液，全部试验组经无血清DMEN培养液漂洗1次，吸弃洗涤液；正常组加DMEM维持液，DGlaN,LPS损伤组与五灵胶囊3个剂量组分别加含有0.5mmol/LDGlaN,20μg/LLPS供试液1
