维拉帕米对lps诱导的大鼠淋巴细胞凋亡及促炎-抗炎细胞因子比例的影响

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　　维拉帕米对LPS诱导的大鼠淋巴细胞凋亡及促炎/抗炎细胞因子比例的影响王震李刚祁晓平黎介寿【关键词】内毒素维拉帕米淋巴细胞凋亡细胞因子0引言　　近来研究发现维拉帕米能够调控内毒素（LPS）诱导的局部和全身的促炎/抗炎细胞因子的表达，并且能够降低试验动物死亡率〔1-2〕.脓毒症时促炎/抗炎细胞因子与淋巴细胞的凋亡之间的关系很复杂，而且维拉帕米对循环内淋巴细胞的凋亡、促炎/抗炎细胞因子平衡方面的体内研究很少.因此本研究旨在探讨维拉帕米对LPS诱导的促炎/抗炎细胞因子平衡、淋巴细胞凋亡的影响，及其循环内促炎/抗炎细胞因子比例与淋巴细胞凋亡的关系.1材料和方法1.1材料成年雄性SD大鼠(体质量250~300g)由南京军区南京总医院实验动物中心提供，实验前禁食8h.LPS,维拉帕米，密度梯度离心液Histopaque1.077均购于美国Sigma公司；凋亡试剂盒购于南京凯基生物科技发展公司；TNFα,IL6和IL10ELISA试剂盒购于美国Biosource公司. 1.2方法1.2.1分组及处理42只大鼠随机均分为7组：空白对照组(A)；LPS组(B)；(C～F)不同剂量维拉帕米组；维拉帕米对照组(G).C～F组大鼠分别给予1,2.5,5,10mg/kg维拉帕米腹腔注射30min后；B～F组大鼠给予腹腔注射LPS(10mg/kg,1μL/g)，LPS用90mL/L无菌生理盐水配置成1mL/L浓度；G组仅给予10mg/kg维拉帕米.以上各组均于注射后1h，麻醉、处死大鼠，取不抗凝血离心（2000g，4℃，15min）后，得血清置于-80℃待检测，留取抗凝血2～3mL分离淋巴细胞.1.2.2分离淋巴细胞淋巴细胞通过密度梯度离心法分离，2～3mL抗凝血置于Histopaque1.077上层，离心700g，30min.分离得细胞PBS洗涤两次后，1∶9加入冰红细胞裂解液(mmol/L)NH4Cl155,KHCO310,EDTA0.1,4℃，7min.淋巴细胞纯度约98%，活度约97%.1.2.3流式细胞术检测淋巴细胞凋亡淋巴细胞凋亡采用试剂盒说明书进行检测.调整浓度至1×109/L,以200g离心5min，弃上清，PBS洗1次,离心，弃上清，悬浮于500μL结合缓冲液，加入2μLannexinVFITC和5μLPI染液，混匀后室温、避光15~30min，流式细胞术检测.凋亡细胞表型为AnnexinV+/PI-.1.2.4检测细胞因子浓度血清TNFα,IL6和IL 10浓度采用ELISA试剂盒检测，操作严格按照说明书进行.统计学处理：计量数据采用x±s表示.统计分析采用SPSS软件包进行，采用非参数秩和检验（MannWhitneyU），P0.05为有统计学差异.2结果2.1维拉帕米对LPS诱导的循环内TNFα/IL10和IL6/IL10比例的影响我们在A组和G组血清中，未能检测出IL10表达.LPS能够诱导血清内TNFα,IL6和IL10表达；与B组比较，C～F组TNFα/IL10和IL6/IL10比例显著下降（P0.01），维拉帕米对TNFα/IL10比例的抑制呈剂量依赖性，以C组降低最明显(P=0.002)；而其对IL6/IL10比例的抑制作用未见明显剂量依赖关系(表1).2.2维拉帕米对LPS诱导的循环内淋巴细胞凋亡的影响与A组比较，B组淋巴细胞凋亡明显增加（P=0.002），C～E组淋巴细胞凋亡较B组皆有不同程度下降（P0.01），呈剂量依赖关系，以C组降低最明显（P=0.002）.而与A组比较，G组淋巴细胞凋亡未见明显变化（P=0.937,表1).3讨论 　　脓毒症时机体表现为短时间的促炎症状态（全身炎症反应综合征，SIRS），释放大量的促炎症细胞因子，以及持续的抗炎症状态（代偿性抗炎症反应综合征，CARS），以辅助性T细胞（TH）向TH2细胞转化增加，TH2细胞反应占优势.根据Ronco等〔3〕提出的“免疫平行假说”，Cavaillon等〔4〕认为脓毒症时，SIRS在炎症组织内占优势，外周血白细胞表现出低反应性.外周白细胞的低反应性可能与脓毒症时循环内淋巴细胞减少有关.临床研究已证实脓毒症患者外周血淋巴细胞数量明显减少.由于LPS诱导的淋巴细胞凋亡是淋巴细胞死亡的主要原因之一，且近来在脓毒症动物模型中也证实抑制淋巴细胞凋亡能够改善实验动物死亡率.因此，淋巴细胞凋亡的改变对于机体免疫与炎症之间的平衡有着重要的作用.我们发现在LPS注射1h后，循环内淋巴细胞凋亡明显增加；而且我们前期实验发现LPS能够诱导肝组织呈高炎症状态，释放大量促炎细胞因子〔2〕，这与免疫平行假说是一致的.　　有研究者认为促炎/抗炎细胞因子比例与脓毒症患者与动物模型的预后有直接关系，促炎/抗炎细胞因子比例升高提示脓毒症患者预后不良〔5〕.本研究发现维拉帕米能够抑制LPS诱导的促炎/抗炎细胞因子比例增高，以及下调淋巴细胞凋亡，且对于TNFα/IL10与淋巴细胞凋亡的抑制作用呈剂量依赖关系，随着维拉帕米剂量的增加，抑制作用减弱，以1mg/kg剂量维拉帕米抑制作用最明显.而且脓毒症时循环炎症细胞因子与淋巴细胞凋亡的关系非常复杂，一方面，T淋巴细胞是细胞因子的主要来源之一. 另一方面，炎症细胞因子能够影响淋巴细胞凋亡.我们认为维拉帕米调节促炎和抗炎细胞因子平衡，与其对淋巴细胞凋亡的抑制可能有一定关系.　　我们推测维拉帕米可能是一种有前途的免疫调节剂，其能够调节脓毒症机体免疫/炎症状态，缓解脓毒症引起的多器官损伤.但是本实验是体内实验，维拉帕米作用的具体的分子机制仍然有待进一步的研究.【