dnapkcs表达与鼻咽癌细胞株放射敏感性的关系论文

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1、DNAPKcs表达与鼻咽癌细胞株放射敏感性的关系论文曲颂，朱小东，黎丹戎，张玮，曹骥【摘要】目的探讨不同放射敏感性鼻咽癌细胞株E1(鼻咽高分化鳞癌细胞株)和E2(鼻咽低分化鳞癌细胞株)中DNA依赖蛋白激酶（DNAPK）的催化亚基DNAPKcs基因的表达与鼻咽癌细胞放射敏感性的关系。方法通过克隆形成实验测定E1、E2不同剂量的存活分数，并用线性二次模型拟合剂量存活曲线求出放射生物学参数α、β、SF2、MID值，以及四氮唑蓝比色分析法（MTT法）检测60Coγ线4Gy照射后12h细胞的存活率，以评价两株细胞的放射敏感性。逆转录实时荧光定量PCR技术（RTFQPCR）检测照射

2、前、后不同时间及不同剂量E1、E2细胞mRNA水平DNAPKcs基因的定量表达。结果E1在各个剂量点的存活分数均比E2高.freelinetherelationshipbetportantponentinNHEJpathacelllines.MethodsRadiosensitivityparametersofnasophryngealcarcinomacelllinesingassayandirradiationdosesurvivalcurveodel.TheticalchangesoftheexpressionofDNAPKcsinmRNAlevelofE1andE

3、2e.ConclusionE2ismoreradiosensitivethanE1.TheexpressionofDNAPKcsgeneiscorrelateda.Keyacellline；RTFQPCR；DNAPKcs；Radiosensitivity0引言放射治疗是治疗鼻咽癌的主要手段，但临床上患者对放射敏感性存在个体差异，因此，放射治疗前即对放射敏感性作预测性分析是目前放射生物学研究的课题之一。DNAPKcs是DNA依赖蛋白激酶（DNAPK）的催化亚基，属于PI3K激酶家族，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性［1，2］，参与DNA双链断裂缺口的修复。由于细胞的放射敏感性与照

4、射后DNA双链断裂损伤修复的关系密切［3］，近年来已有研究证明DNAPKcs催化亚基可能与肿瘤细胞的放射敏感性有关。本实验通过对不同放射敏感性鼻咽癌细胞株E1、E2照射前后及照射后不同时间DNAPKcs基因表达的检测，探讨其与鼻咽癌放射敏感性的关系，为临床上从基因水平对NPC放射治疗进行干预提供理论基础。1材料与方法1.1材料E1（人鼻咽癌高分化鳞状细胞癌细胞）及E2（人鼻咽癌低分化鳞状细胞癌细胞）由本院中心实验室提供，培养条件为含10%小牛血清及青、链霉素的RPMI1640培养基，5%CO2孵箱37℃孵育。1.2照射条件及方法采用加拿大THERATRONICS780C60C

5、o远距离治疗机,剂量率为108～111cGy/min，源皮距80cm，调整细胞上方培养液深度为5mm，以此作为60Coγ射线照射所需剂量建成区。1.3照射细胞存活曲线设0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、16Gy剂量点,取上述指数生长期细胞，用0.25%的胰酶消化成单细胞悬液细胞消化后制成悬液,以102的密度接种细胞于直径6cm培养皿中,待细胞贴壁后照射。照射后细胞继续培养10～14天，待出现可见集落时终止培养，弃培养液，甲醛固定，姬姆萨染色，计数细胞数50个以上的集落数，每个剂量点设3个平行样本。计算细胞存活率，计算机按线性二次模型(LQ模型)拟合，绘制细胞存活曲线，求PE、α、

6、β、SF2、MID值。1.4MTT法检测单次照射后细胞存活率96孔板接种细胞,每孔104个,每个时间点设6孔，培养48h后单次照射4Gy。未照射和照射后细胞在5%CO2孵箱37℃孵育后，分别于照射后3、6、12、24、36、48h以10∶1的体积加MTT(5mg/ml)，作用4h后吸弃培养液，每孔加0.2ml的DMSO使细胞裂解,.freell培养瓶中，行0～16Gy照射后12h采用小量柱离心式细胞总RNA抽提试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）提取细胞总RNA，具体操作步骤详见说明书。按照MMLV反转录试剂盒（MBI公司）说明书操作合成cDNA模板。1.6引物的设计与合成根据GenBank

7、中GAPDH和DNAPKcs的mRNA序列，由Primer3在线设计，上海生工生物技术有限公司合成，各引物序列设计如下：GAPDH（GI：7669491）F：5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′，R：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGT3′，扩增片断长度225bp；DNAPKcs(GI：13570016)F：5′ATCTCTTAAAGCGGGCCTTCG3’，R：5′AGGCATCAAC