放射敏感性不同的鼻咽癌细胞株X线辐射后MiR-7与其上下游调控基因的表达变化

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1、中文摘要有关。HOX基因家族在胚胎发育，肢体数量与形态，腰骶部脊髓的发育，运动神经元的分化起着重要的调节作用。在某些器官中，HOX基因家庭具有特异性表达谱，原发于这些器官的肿瘤及其转移至远处的肿瘤，均与其来源的正常组织细胞有相同的HOX基因表达谱。HOX基因家族编码DNA转录调节蛋白，如果HOX基因表达混乱，将会导致血液肿瘤或实体瘤的发生。在组织器官发育完成后，HoxDlO仍然起着重要的调控作用，这种作用体现在抑制新生血管生成，抑制肿瘤形成，抑制肿瘤远处转移。虽然可被microRNA抑制，但HoxDlO作为编码转录调节蛋白的HOX基因家族成员之

2、一，也可在转录水平调节microRNA的表达。已知HoxDlO在乳腺癌细胞中调节miR-7的表达。因此，抑制EGFR是降低肿瘤细胞放射抵抗性中一个重要的环节，miR-7在调节EGFR转录过程中有重要的作用，而miR一7上游调控因子HoxDlO也可能与放射敏感性有关，但活体鼻咽癌细胞中miR一7与HoxDlO结合验证未有报道。本研究着重从基因表达水平，初步探讨放射敏感性不同的鼻咽癌细胞X线辐射后miR-7与EGFR基因表达，miR-7与HoxDlO基因表达的相关性，并验证HoxDlO与miR一7的启动子序列在鼻咽癌细胞中是否结合，从而确定在鼻咽癌

3、细胞中HoxDlO是否参与了miR-7的表达调控。第一部分：鼻咽癌细胞株状态测定目的：绘制南方医院肿瘤中心提供鼻咽癌细胞株CNE-I、CNE-2的生长曲线，确定其对数生长期，并检测对数生长期细胞的放射敏感性。方法：用MTT法，经酶标仪检测，得出细胞不同生长天数的OD值，输入Excel软件，绘制CNE—l、CNE一2细胞的生长曲线；使用克隆计数法，计算细胞受X线辐射后细胞存活分数，采用GraphPadPrism5．0软件，按线性二次模型拟合两种细胞存活曲线，求出相应的数学模型参数Q、B、CI／B值。结果：CNE-I的对数生长期为5’7天，CNE-

4、2细胞对数生长期为3’5天；CNE一1细胞放射敏感性较CNE-2细胞低。n硕士学位论文第二部分：X线辐射后鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2的miR7及EGFR表达变化目的：通过检测放射敏感性不同的鼻咽癌细胞株X线辐射后，miR一7及EGFR的表达变化，探讨二者表达是否有相关性。方法：两种细胞均分为对照组(未辐射)、2Gy组和8Gy组，X线照射后10小时，用Trizol法提取细胞总RNA。茎环法特异性逆转录miR-7，01igodT逆转录EGFRmRNA，设计特异性PCR引物，进行染料法实时定量PCR，以对照组CNE-1细胞为参照样本，△△Ct

5、法得出各样品miR一7和EGFR的相对数。结果：放射抵抗的细胞株CNE．1低剂量X线照射后miR．7升高明显，高剂量照射后升高不明显。放射敏感的细胞株CNE．2X线照射后，miR．7表达下降，以低剂量照射下降更为明显。放射抵抗的细胞株CNE．1低剂量x线照射后EGFR表达增加，且随着照射剂量的增加而增加。放射敏感的细胞株CNE．2X线照射后，EGFR表达也增加，但未随着照射剂量的增加而增加。第三部分：X线辐射后上游调控因子HoxDlO的表达变化目的：通过检测放射敏感性不同的鼻咽癌细胞株X线辐射后，HoxDlO的表达变化，探讨其与miR一7的表达

6、变化的相关性。方法：两种细胞均分为对照组(未辐射)、2Gy组和8Gy组，X线照射后10小时，用Trizol法提取细胞总RNA。OligodT逆转录mRNA，设计HoxDlO特异性PCR引物扩增cDNA片段，进行染料法实时定量PCR，以对照组CNE一1细胞为参照样本，△△Ct法得出各样品HoxDl0的相对数。结果：与对照组相比，X线辐射后，各组HoxDl0表达均显著下降。两种细胞受X线辐射后，HoxDl0表达均明显下降。第四部分：miR-7上游启动子序列的预测、与HoxDl0调控因子结合的验证目的：查找miR-7上游2Kb范围内启动子所在区域、可

7、能与调控因子的结合位点及其序列。验证活体细胞中HoxDl0调控因子与预测的启动子区域是否结合。IIl中文摘要方法：通过PubMed查找关键词或题目或摘要为miR一7文献。通过miRbase查找miR-7在人类染色体中的位置，再通过UCSC查找上游2Kb范围内启动子区域的特征。甲醛固定后，超声破碎细胞，将细胞DNA破碎至1000bp左右的片段，加入ProteinA及HoxDl0抗体，提取HoxDl0蛋白结合的DNA片段，设计扩增启动因子所在DNA片段的PER引物，扩增提取的DNA片段，验证HoxDl0蛋白结合的DNA片段是否与启动子所在片段相同。

8、结果：miR一7的上游启动子所在区域为-958至-968、-1019至-1028两个位点，CHIP实验结果证实HoxDl0与上述两个点结合。关键词：鼻