反义krt13质粒对鼻咽癌细胞株放射敏感性的影响

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1、反义KRT13质粒对鼻咽癌细胞株放射敏感性的影响　　鼻咽癌(NPC)是一种恶性上皮肿瘤，具有显着的地域性和种族性。在我国广东省，鼻咽癌的发病率居于世界首位，每年平均10万人中就有30～80例患病。目前多采用放射性治疗鼻咽癌，但癌细胞的辐射抗性可导致治疗失败，肿瘤局部失控或复发。因此，如何逆转肿瘤的辐射抗性是鼻咽癌治疗所面临的新问题。　　细胞角蛋白(Cytokeratins)因在组织发生恶变后会出现差异性表达，被广泛应用于肿瘤的诊断。其中，角蛋白13(Keratin-13，KRT13)已经在各种癌症中发现，同时有研究认为它与细胞的放

2、射敏感性有关。本研究首次构建反义KRT13慢病毒质粒，筛选出稳定转染该慢病毒的鼻咽癌细胞株anti-KRT13-HNE-1，并进一步探讨反义KRT13质粒对鼻咽癌细胞株放射敏感性的影响，为鼻咽癌新的基因－放射联合治疗提供理论基础。　　1材料与方法　　1．1实验材料人鼻咽癌高分化鳞癌细胞株HNE-1由湘雅医学院肿瘤中心提供。pLV-EGFP慢病毒载体及包装系统购自北京英茂盛业生物科技有限公司。pUC57-KRT13由本科室构建。G418和PI购自美国Sigma公司。Trizol购自Invitro-gen公司。cDNA第一链合成试剂盒

3、和荧光定量PCR试剂盒均购自北京天根生化公司。　　KRT13和β-actin小鼠一抗、HRP标记羊抗小鼠二抗均购自美国SantaCruz公司。RIPA裂解液、ECL化学发光试剂盒和AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒均购自碧云天公司。　　1．2细胞培养人鼻咽癌高分化鳞癌细胞株HNE-1用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。　　1．3质粒构建反义KRT13设计的带有酶切位点引物，上游:(BamHI)GGATCCGCACCTGCTCTCAAT，下游:(AplI)

4、GGGCCCAACCCCCACCAAAGCCA，采用PCR法从已有的质粒模板pUC57-KRT13中扩增出所要的片段，随后用BamHI和AplI双酶切并回收，用T4连接酶与pLV-EGFP慢病毒质粒反向连接过夜得到连接产物。根据pLV-EG-FP慢病毒包装系统说明书进行操作。　　1．4细胞感染及筛选稳定表达反义KRT13细胞系PBS稀释上清，并依照文献测定病毒滴度。将病毒依照滴度测定的量感染HNE-1细胞3次，并定期在荧光显微镜下观察，当细胞均出现绿色荧光后即得到稳定的细胞株用于后续实验。　　1．5各组细胞中KRT13的检测按数字

5、随机法将细胞分为control(正常HEN-1细胞)组、lentivirus(转染慢病毒空载体)组和anti-KRT13(转染慢病毒质粒组)，以Tr-izol法提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，取2μlmRNA使用cDNA逆转录试剂盒合成cDNA第一链，按照荧光定量试剂盒说明对各组细胞的cDNA进行相对定量检测。扩增条件:变性95℃2min;95℃15s，60℃30s(35个循环);溶解曲线阶段依照仪器说明设定。结果采用2-ΔΔCt方法进行mRNA表达差异分析。　　收集各组对数生长期细胞，RI

6、PA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法进行定量检测。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，加入小鼠一抗后4℃过夜孵育，TBST洗膜3次(5min/次)，加入稀释的HRP标记羊抗小鼠二抗，室温孵育2h;TBST洗膜3次(5min/次)后，进行化学发光检测。β-actin作为内参进行进一步处理。　　1．6细胞辐射选取指数生长期细胞，经0．25%胰酶消化制成单细胞悬液，计数细胞浓度，按预定数量接种于6孔板中，置于培养箱中孵育12h后，采用Varian2300EX直线加速器6MV-X

7、线照射，剂量率400cGy/min，垂直辐射细胞，细胞上面覆盖1cm有机玻璃填充物帮助剂量建成，固定源皮距SSD100cm，照射野面积10cm10cm。　　1．7细胞周期实验指数生长期细胞经2Gy照射24h后进行收集，加入70%冰乙醇中4℃过夜，PBS洗涤3遍后，避光将细胞加入到含有50μg/ml的RNA酶和50μl/mlPI染色液中，室温孵育30min后，流式细胞仪检测细胞周期各时相所占比例。　　1．8细胞凋亡检测指数生长期细胞经2Gy照射24h后，胰酶消化并用PBS洗涤3遍，重悬细胞离心后弃上清，加入190μ

8、lAnnexinV-FITC溶液轻轻重悬细胞，室温孵育10min后，再加入5μl碘化丙丁(PI)染色液，轻轻混匀。冰浴避光放置。随即进行流式细胞术检测。　　1．9克隆形成实验3组细胞按预定数量接种于6孔板中，每组均设0、1、2、4、6、8Gy