邻苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色谱法检测珍珠粉中的氨基酸含量

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1、邻苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色谱法检测珍珠粉中的氨基酸含量作者：陈稚，陈波，揭新明，张立坚【摘要】目的测定珍珠粉中的氨基酸含量。方法邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生反相高效液相色谱法，采用荧光检测，梯度洗脱。结果该法在28min之内分离出15种氨基酸。结论该法样品用量少、灵敏度高、线性范围宽、重现性好，适于分离大量样品。【关键词】高效液相色谱；柱前衍生法；氨基酸；珍珠粉　　DeterminationoftheContentsofAminoAcidsinPearlPonDerivationinedaminoacidsinpearlpoanualpre-columnderiva

2、tionprocedurehasbeendevelopedbyreversed-phaseHPLCinoacidsin.ConclusionThemethodissensitive,preciseandshoanceliquidchromatography；Precolumnderivation；Aminoacids；Pearlpool级。常用的衍生方法有：DABS法（衍生剂为磺酰氯二甲胺偶氮苯DABSYLCl)、DNS法(衍生剂为丹酰氯DANSYLCl)、FMOC法(衍生剂为氯甲酸芴甲酯FMDCCl)、PITC法(衍生剂为异硫氰酸苯酯PITC)和OPA法

3、(衍生剂为邻苯二甲醛OPA)等［1，2］。前4种方法存在反应活性差、速度慢、灵敏度低、反映试剂干扰等缺点，而OPA法具有衍生步骤简单、反应速度快、剩余试剂不干扰测定等优点，其应用最为广泛［3，4］。本文用asslynxTM3.5色谱管理系统（g/ml，用氨基酸标准品溶于0.1mol/L盐酸配制。OPA衍生试剂：取500mgOPA和10ml甲醇,加入100ml0.4mol/L硼酸钠水液，用氢氧化钠调pH值至10，最后加入400μl的巯基乙醇，混匀，置4℃冰箱中保存。　　15种氨基酸标准品由中国疾病预防控制中心购得（中国，北京）；甲醇（色谱纯）上海陆都化学试剂厂；盐酸，氢氧

4、化钠，硼酸钠，乙酸钠，巯基乙醇均为分析纯由上海三浦化工有限公司购得。　　2方法与结果　　2.1工作条件色谱柱：RPC18色谱柱；流动相A为0.05mol/L醋酸钠水液∶四氢呋喃∶甲醇=96∶2∶2（V∶V∶V）(%)；流动相B为甲醇：水=65∶35（V∶V）(%)；梯度洗脱条件（见表1）；进样前，柱子用流动相A平衡10min。荧光检测器：发射波长338nm，激发波长430nm。　　2.2衍生及分析分别取2μl氨基酸的混合标准溶液或样品溶液和2μlOPA衍生试剂，在注射器中来回抽取5次，混合均匀后(定量环为20μl)直接注入高效液相色谱仪进行分析，以保留时间定性，峰面积外

5、标法定量。　　表1梯度洗脱条件（略）　　2.3方法学考察　　2.3.1标准曲线制作在0.05～100mg/ml浓度范围内，由6个浓度水平来绘制校正曲线。以峰面积为纵坐标，目标物相应的浓度为横坐标做校正曲线，绘制标准曲线，得回归方程。15种氨基酸峰面积和浓度之间的线性相关系数r值在0.9215～0.9995之间，色谱图见图1。　　2.3.2精密度试验标准溶液连续5次进样，15种氨基酸的保留时间和峰面积的变异系数分别为0.09%～0.28%和0.8%～4.2%。　　2.3.3重复性试验取5份样品依法进行测定，日内、日间变异系数均＜7.5%。　　2.3.4加样回收率试验3个空白

6、样品中添加低、中、高三个浓度水平的标准品完成，通过对比检测的量和实际加入的量来计算，结果平均回收率在85.2%～103.6%之间。　　2.4样品测定本实验供试样品为珍珠粉（15g）在500ml人工胃液溶液（10mg/ml胃蛋白酶的水液，含1.64%稀盐酸，37℃±0.5℃）中的溶出样品，购自市场。表2为某一时间内NM组（纳米粉体溶出量样品）、C组，各单个氨基酸的含量不符合上述规律，这是因为供试样品在人工胃液中水解出游离氨基酸的程度不同。本实验能够简单、方便、快速、灵敏和准确可靠地测定珍珠粉中的15种氨基酸含量，且容易推广应用。因此该法适用于大批量样品的分析检测，可成为科研

7、和生产过程中分析测定氨基酸的一种优先选择方法。【参考