pc12细胞缺糖损伤的分子生物学特征论文

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1、PC12细胞缺糖损伤的分子生物学特征论文宋晓冬蒋少锋牛新华徐艳岩武玉永单长民【关键词】细胞【摘要】目的在体外模拟能量代谢障碍研究PC12细胞缺糖损伤的分子生物学特征。方法电镜观测形态改变，MTT检测功能异常，RTＰＣＲ测定Bcl２在RNA水平上的表达。结果电镜观察到细胞有凋亡现象；MTT显示细胞活力降低；RTＰＣＲ结果表明Bcl２在6~１６h表达上调。结论缺糖损伤的PC12细胞既有形态的变化也有功能上的变化，并同时伴随着凋亡和坏死两种死亡现象。【关键词】PC12细胞；缺糖损伤；凋亡【Abstract】ＯbjectiveＢyusingglucosedeprivation(an

2、insultrelevanttothebrainischemia)media,PC12cellstrainolecularbiologicaltechniquesincludingelectronmicroscopy,MTT,andRTＰＣＲtomeaureandobserve.ＲesultsElectronmicroscopyrevealsthetreatedPC12cellsunderentandthendeclinedgradually.ＣonclusionThePC12cellsdeprivedofglucoseunderorphologicalandfunctio

3、nalalterationsincludingapoptosisandnecrosis.【Keya公司，RTＰＣＲ引物由上海生工生物技术有限公司合成：βactina5’AACCGTGAAAAGATGACCCAG３’,５’ＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴ３’;Bcl２５′ＣＡＣＣＣＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴ３′，５′ＧＴＴＧＡＣＧＣＴＣＣＣＣＡＣＡＣＡＣＡ３′，EagleEyeⅡ凝胶成像分析仪美国Stratagene公司生产，FR９００DNA热循环仪购自上海复日生物实验技术研制所。１．２方法１．２．１ＰＣ１２细胞对照组及缺糖实验组的建立：PC12细胞接种于培养瓶

4、内，加入含10%胎牛血清、5%马血清的DMEM细胞培养液3ml，每2~３d更换一次培养液，待培养形成的细胞汇合成单层细胞以后，用025%胰蛋白酶消化传代或接种于培养板上，保持细胞状态良好以备实验使用。ＰＣ１２细胞先以有糖DMEM培养液培养于25ml培养瓶内，待细胞生长至铺满瓶壁后换入10%胎牛血清、5%马血清的DMEM无糖细胞培养液3ml，无糖培养时间根据不同需要选取不同时间段。122电镜观察细胞形态变化：取实验组对照组细胞，放入15mlEp管，4000r/min5min，弃上清，沉淀用PBS混匀，4000r/min5min。如此重复三次后得细胞沉淀块进行如下操作：①固定：

5、戊二醛2h，PBS冲洗5min3次，锇酸2h，PBS冲洗5min3次。②脱水：50%乙醇15min，70%乙醇15min，90%乙醇15min，90%乙醇与90%丙酮(1∶１）15min，90%丙酮15min，100%丙酮15min3次。③浸透：100%丙酮＋包埋液(1∶1)4h，包埋液2h。④环氧树脂618包埋。⑤固化：37℃12h、４５℃12h、６０℃24h。⑥超薄切片：修理细胞块后在LKB超薄切片机上用玻璃刀切片，厚度为5～１０nm。⑦染色：醋酸铀30min，枸杞酸铅10min。⑧电镜下观察细胞形态。１．２．３MTT比色法检测细胞活力：选取实验组对照组各6孔，实验组缺

6、糖时间分别是1、３、９、２４、４８h。每孔加15μlMTT溶液，放入37℃５％ＣＯ２培养箱中培养4h。100μl异丙醇终止，室温30min。酶标仪570nm处测定OD值。１．２．４反转录聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RTＰＣＲ)：选取实验组对照组细胞，将培养皿中的培养液彻底弃干净，加入1mlRNAexReagent,将细胞并RNAexReagent一起移入15ml离心管中。室温静置5min，再加入200μl氯仿，用力颠倒离心管以混匀。静置5min后，12000r/min高速离心10min。小心将上层水

7、相移至15ml离心管中，加入500μl异丙醇，振荡混匀，室温静置8min。高速离心5min，小心弃上清。加入1ml75%乙醇，振荡片刻，7500r/min离心5min,小心弃上清。室温静置12min使RNA沉淀恰好干燥，加入水溶解RNA。720分光光度计上测260nm、２８０nm的OD值，计算RNA的浓度。取等量RNA、OligdT、ＤＥＰＣ水共13μ1。７０℃加热8min，立即将微量离心管冰浴至少1min，然后加入下列试剂：5×buffer5μl，dNTPs5μl，ＭＭＬＶＲＴ１μl，Ｒasin1μl，轻轻混匀，