iκbα突变型基因对缺氧缺糖损伤永生化神经前体细胞的保护作用论文

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1、IκBα突变型基因对缺氧缺糖损伤永生化神经前体细胞的保护作用论文祝畅刘志恒张传汉桂伶俐姚文龙【摘要】目的：检测在缺氧缺糖环境中，IκBα突变型基因对永生化神经前体细胞株（INPCs）NFκB的活性、细胞存活及细胞损伤的影响.方法:在建立转染pcDNA3.1及转染pcDNA3.1/IκBαMINPCs的基础上，用MTT法检测缺氧缺糖处理3，6和9h后两细胞株的存活率，用荧光素酶报告基因检测两细胞株缺氧缺糖6h前后NFκB的活性，并测定缺氧缺糖6h处理后培养液中乳酸脱氢酶的含量，用Hoechst33342染色观察细胞核的形态.结果：转染pcDN

2、A3.1/IκBαM的INPCs中NFκB的活性均低于转染pcDNA3.1的INPCs，缺氧缺糖6h或9h时.freelinetheeffectofmutatedIκBαgeneonimmortalizedneuralprogenitorcellstrains(INPCs)inoxygenglucosedeprivation.METHODS:AftertheestablishmentofmutatedIκBαgenetransfectedINPCsandblankplasmidtransfectedINPCs,thecellsiccondi

3、tionfor3,6or9hrespectively.MTTstainingediumeasuredafterthecellsicconditionfor6h.Themorphologicalchangeofticconditionfor6hor9h,butthereicconditionfor6h,lactatedehydrogenasecontentinculturemediumutatedIκBαgeneimprovesthecellsurvivalrateofINPCsandlessensthecelldamagecausedbyoxy

4、genglucosedeprivation.【Keycells;NFkappaBinhibitoralpha;cellhypoxia0引言我们实验室已成功构建了转IκBα突变型基因永生化大鼠神经前体细胞株（immortalizedneuralprogenitorcellstrain,INPCs）［1］，并证实该细胞株中IκBα突变型基因可下调NFκB的活性，使部分炎性细胞因子的表达减少.由于NFκB的作用广泛且复杂，其活性的变化在不同细胞及不同刺激情况下所引发的效应不同［2］.我们拟检测在正常及缺氧缺糖培养条件下，转染IκBα突变型基

5、因及对照载体的INPCs细胞存活及受损的情况，为进一步探讨IκBα突变型基因影响细胞活性的可能机制和转染IκBα突变型基因INPCs的应用前景奠定基础.1材料和方法1.1材料转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs由本实验室构建，NFκB荧光素酶报告质粒6×κB由德国HeikeLPahl教授惠赠.DMEM/F12培养基,B27无血清培养添加剂,脂质体lipofectamineTM2000（美国Gibco公司）；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),表皮生长因子(EGF)（英国PeproTech公司）；MTT，hoechst

6、33342（美国Sigma公司）；荧光素酶检测试剂盒（美国Promega公司）；酶标仪（美国BioRad公司）.1.2方法1.2.1MTT法检测细胞存活率将转染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs置无血清培养基培养，培养基成分为：DMEM/F12培养基添加bFGF，EGF各20μg/L，1×B27，青、链霉素各1×105U/L，以5×108/L的密度接种于96孔板，每孔0.1mL，每株细胞每板接种24孔，共种4板，置37℃50mL/LCO2培养箱培养24h后留一板作为对照组，其余3板作为实验组，将实验组培养液换为无糖Ea

7、rles液后，利用三气水套式培养箱，充以N2，使O2浓度维持在30mL/L，CO2浓度为50mL/L，分别处理3，6和9h，然后将4板的培养液均换为DMEM/F12培养基，加入0.02g/LMTT50μL/孔，继续在37℃50mL/LCO2条件下培养4h，吸去上清液，加入150μL/孔DMSO，震荡混匀，在酶标仪上测定A570nm，以对照组的细胞存活率为100%,以细胞存活率=实验组A570nm/对照组A570nm×100%计算细胞存活率.1.2.2NFκB荧光素酶报告基因的检测用脂质体转染法将含有NFκB启动荧光素酶报告基因的质粒6×κ

8、B分别转入等细胞密度的稳定转染pcDNA3.1的INPCs及转染pcDNA3.1/IκBαM的INPCs中，48h后将一批细胞置原培养环境，另一批细胞