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1、通塞脉微丸和丁基苯酞对PC12细胞缺氧缺糖损伤模型的保护作用论文.freelaipellets(TSMP)andbutylphthalide(NBP)onPC12cellinthehypoxia/hypoglycemiamodel.MethodsTiamodelsincludinghypoxia,hypoglycemiamodelsicrolesofTSMPandNBPinculturedPC12.ResultsTSMPandNBPpossessedobviousprotectiveeffectsonPC12cellsfromtodels.Bothofthemcouldincrea
2、sethenumberoflivingcellsanddecreaseLDHactivitysignificantly,particularlyinhypoglycemiainjuredmodel.ConclusionTSMandNBPhaveprotectiveeffectonPC12cellsfromtodelseffectivelyinvitro.Keyaipellets；butylphthalide；PC12cell；hypoxiamodel；hypoglycemiamodel通塞脉微丸(TSMP)是在中成药通塞脉片的基础上经拆方二次开发而成的新的复方制剂。该制剂以黄芪、当
3、归等为基本组成药物,具有补益气血、养阴清热、活血化瘀、通经活络等功效,临床用于治疗缺血性脑中风。丁基苯酞(NBP)为当归挥发油的主要成分,在有效部位筛选实验中发现当归的超临界萃取物有较好的抑制血小板聚集和促进血管生成的作用,NBP与全方制剂治疗缺血性脑中风的疗效密切相关。另有文献报道,.freelascioentific)；Pureplus纯水器(U.S.A)；SIL型倒置显微镜；TU-1800S紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。1.2药物与试剂TSMP自制；NBP购自中国医学科学院；丹参酮(Tanshinone,TAN)自制。以上各药配置后经微孔滤膜除菌过滤,4℃冰
4、箱保存备用,实验时用1640培养液稀释成不同的浓度。连二亚硫酸钠(Na2S2O4)为上海硫酸厂双流工贸公司产品,批号970531；PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆株,引自武汉大学菌种保藏中心,本研究室传代保存)；1640培养基、MTT(四甲基偶氮唑盐)购自Sigma公司；小牛血清购自杭州四季青有限公司；二甲基亚砜(DMSO),上海凌峰化学有限公司,批号060514；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所,批号070524。2实验方法2-42.1药物对实验模型的保护作用2.1.1细胞的接种接种1×105/mL的PC12细胞于96孔培养板中,37℃、5%CO2温箱孵
5、育6h。2.1.2缺氧损伤模型的建立和药物对实验模型的保护作用将Na2S2O4干粉加入1640培养液中,使终浓度为0.87mg/mL,充分搅拌,调整pH为7.2,即为缺氧溶液。将缺氧溶液180μL加至PC12细胞上,再加入不同浓度的TSMP、NBP和TAN各20μL,CO2培养箱中作用8h,换成正常1640培养液继续培养6h,观察结果。实验除设损伤对照及正常对照外,还设非低氧溶液(配制同缺氧溶液,放置3d以上实验)对照,以消除Na2S2O4在水中分解产物的影响。2.1.3缺糖损伤模型的建立和药物对实验模型的保护作用将无糖Eagle’s液加于PC12细胞培养板中,180μL/孔,再加
6、入不同浓度的TSMP、NBP和TAN各20μL,CO2温箱中作用10h,换成正常1640培养液继续培养6h,观察结果。2.2观察指标2.2.1细胞形态学观察倒置显微镜下观察PC12细胞的生长及细胞病变情况。2.2.2MTT法测定PCl2细胞存活数细胞培养实验结束前4h,每孔加入5mg/mL的MTT20μL,37℃、5%CO2温箱中继续培养,待蓝紫色的复合物形成后,加入200μLDMSO,振荡10min,使颗粒彻底溶解,Bio-TEKEL900酶标仪在波长570nm下测定吸光度值。2.2.3乳酸脱氢酶法测定细胞损伤程度收集细胞培养上清液,按LDH测试盒说明操作并计算LDH活力。2.3
7、统计学方法数据以x±s表示,组间数据进行t检验。3结果3.1细胞形态学观察PC12细胞形状呈不规则圆形,为贴壁细胞,折光度强,生长速度快,培养3d后细胞生长成簇。损伤后,细胞先肿胀,折光度减弱,最终细胞圆缩,脱落。模型中PC12细胞的损伤及药物保护的形态学表现基本一致。3.2MTT法活细胞测定(见表1、表2)表1TSMP对缺氧、缺糖损伤模型中PC12细胞存活数的影响(略)注：与对照组比较,▲P0.01；与模型组比较,*P0.05,**P0.01(下同)表2NBP对缺氧
