pc12细胞缺糖损伤的分子生物学特征

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1、PC12细胞缺糖损伤的分子生物学特征【关键词】细胞　　【摘要】目的在体外模拟能量代谢障碍研究PC12细胞缺糖损伤的分子生物学特征。方法电镜观测形态改变，MTT检测功能异常，RTＰＣＲ测定Bcl２在RNA水平上的表达。结果电镜观察到细胞有凋亡现象；MTT显示细胞活力降低；RTＰＣＲ结果表明Bcl２在6~１６h表达上调。结论缺糖损伤的PC12细胞既有形态的变化也有功能上的变化，并同时伴随着凋亡和坏死两种死亡现象。　　【关键词】PC12细胞；缺糖损伤；凋亡　　【Abstract】ＯbjectiveＢyusingglucosedeprivation(aninsultrelev

2、anttothebrainischemia)media,PC12cellstrainolecularbiologicaltechniquesincludingelectronmicroscopy,MTT,andRTＰＣＲtomeaureandobserve.ＲesultsElectronmicroscopyrevealsthetreatedPC12cellsunderentandthendeclinedgradually.ＣonclusionThePC12cellsdeprivedofglucoseunderorphologicalandfunctionalalter

3、ationsincludingapoptosisandnecrosis.　　【Keya公司，RTＰＣＲ引物由上海生工生物技术有限公司合成：βactina5’AACCGTGAAAAGATGACCCAG３’,５’ＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴ３’;Bcl２　５′ＣＡＣＣＣＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴ３′，５′ＧＴＴＧＡＣＧＣＴＣＣＣＣＡＣＡＣＡＣＡ３′，EagleEyeⅡ凝胶成像分析仪美国Stratagene公司生产，FR９００DNA热循环仪购自上海复日生物实验技术研制所。　　１．２方法　　１．２．１ＰＣ１２细胞对照组及缺糖实验组的建立：PC12细胞接种于培

4、养瓶内，加入含10%胎牛血清、5%马血清的DMEM细胞培养液3ml，每2~３d更换一次培养液，待培养形成的细胞汇合成单层细胞以后，用025%胰蛋白酶消化传代或接种于培养板上，保持细胞状态良好以备实验使用。　　ＰＣ１２细胞先以有糖DMEM培养液培养于25ml培养瓶内，待细胞生长至铺满瓶壁后换入10%胎牛血清、5%马血清的DMEM无糖细胞培养液3ml，无糖培养时间根据不同需要选取不同时间段。122电镜观察细胞形态变化：取实验组对照组细胞，放入15mlEp管，4000r/min5min，弃上清，沉淀用PBS混匀，4000r/min5min。如此重复三次后得细胞沉淀块进行如下

5、操作：①固定：戊二醛2h，PBS冲洗5min3次，锇酸2h，PBS冲洗5min3次。②脱水：50%乙醇15min，70%乙醇15min，90%乙醇15min，90%乙醇与90%丙酮(1∶１）15min，90%丙酮15min，100%丙酮15min3次。③浸透：100%丙酮＋包埋液(1∶1)4h，包埋液2h。④环氧树脂618包埋。⑤固化：37℃12h、４５℃12h、６０℃24h。⑥超薄切片：修理细胞块后在LKB超薄切片机上用玻璃刀切片，厚度为5～１０nm。⑦染色：醋酸铀30min，枸杞酸铅10min。⑧电镜下观察细胞形态。　　１．２．３MTT比色法检测细胞活力：选取实验

6、组对照组各6孔，实验组缺糖时间分别是1、３、９、２４、４８h。每孔加15　μlMTT溶液，放入37℃５％ＣＯ２培养箱中培养4h。100μl异丙醇终止，室温30min。酶标仪570nm处测定OD值。　　１．２．４反转录聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RTＰＣＲ)：选取实验组对照组细胞，将培养皿中的培养液彻底弃干净，加入1mlRNAexReagent,将细胞并RNAexReagent一起移入15ml离心管中。室温静置5min，再加入200　μl氯仿，用力颠倒离心管以混匀。静置5min后，12000r/

7、min高速离心10min。小心将上层水相移至15ml离心管中，加入500μl异丙醇，振荡混匀，室温静置8min。高速离心5min，小心弃上清。加入1ml75%乙醇，振荡片刻，7500r/min离心5min,小心弃上清。室温静置12min使RNA沉淀恰好干燥，加入水溶解RNA。720分光光度计上测260nm、２８０nm的OD值，计算RNA的浓度。取等量RNA、OligdT、ＤＥＰＣ水共13μ1。７０℃加热8min，立即将微量离心管冰浴至少1min，然后加入下列试剂：5×buffer5μl，dNTPs5μl，ＭＭＬＶＲＴ　１μl，Ｒasin1μl，轻轻混