脐血cd34+细胞体外扩增时hoxb4基因表达的变化

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1、脐血CD34+细胞体外扩增时HOXB4基因表达的变化作者：唐宇宏，费小明，沈文怡，缪扣荣，崔毓桂，汪承亚【摘要】同源盒基因家族成员HOXB4反映原始造血干/祖细胞(PHSC/PHPC)的自我更新和增殖能力。本研究采用实时定量RT-PCR的方法在mRNA水平上检测HOXB4基因的表达，以观察体外扩增脐血CD34+细胞自我更新的水平。结果显示：随着体外培养时间的延长，虽然CD34+细胞数增加，但HOXB4表达下降；周后，HOXB4几乎检测不到，与成熟外周血淋巴细胞表达HOXB4的水平相同；CD34+细胞与骨髓间充质干细胞(BM-MSC)共培养可以减缓CD34+细胞HO

2、XB4表达的下降。结论：脐血CD34+细胞体外扩增过程中自我更新能力逐渐下降。CD34+与BM-MSC共培养有助于减缓体外扩增的CD34+细胞自我更新能力的丧失。【关键词】脐血CD34+细胞　　ExpressionofHOXB4inCordBloodProgenitorCellsExpandedinvitro　　AbstractHOXB4，amemberofhomeoboxgenefamily，iscloselyrelatedtotheself-reneitivehematopoieticstem/progenitorcells(PHSC/PHPC).Thisst

3、udyedtoinvestigatetheself-reneRNAleveleRT-PCR.Theresultsindicatedthatascultureprolonged，thetotalcells，CD34+cellsgreatlyincreased，hoilartothatofmaturelymphocytes.Meanarroesenchymalstemcells(BM-MSC)couldabatethedeclineofHOXB4expression.Itisconcludedthattheself-renearroesenchymalstemcell

4、；realtimeRT-PCR脐血是造血干细胞(HSC)的重要来源，但脐血量有限，单份脐血HSC往往不能满足成年患者移植的需要。因此，许多人致力于体外扩增脐血造血干/祖细胞(CBSC/CBPC)的研究。既往研究表明，FL、TPO、SCF等可以促使原始造血祖细胞增殖，经2周的培养，CD34+细胞数量增加近百倍［1-3］。我们先前采用骨髓间充质干细胞(BM-MSC)共培养，CD34+细胞比值增加更为明显［4］，但对于体外扩增的CD34+细胞自我更新能力的水平并不清楚。最近发现同源盒基因家族成员HOXB4作为一类转录因子，可正性调节HSC的自我更新［5-7］。HOXB4

5、在原始造血干细胞（PHSC）上高表达，随着PHSC向各系分化，表达水平逐渐降低，直至消失［8］。因此认为：HOXB4表达强弱能够作为一种衡量CD34+细胞自我更新能力的标志。本研究以实时定量RT-PCR的方法检测HOXB4的表达，探讨造血因子刺激的单纯培养及以BM-MSC为基质的体外扩增CD34+细胞能否维持其自我更新的能力。　　材料和方法　　主要仪器和试剂　　TripureReagent(Roche，Germay)，AAN荧光引物探针（Appliedbiosystems，USA），TAQMANPCRuniversalMasterMix（Appliedbiosys

6、tems，USA），ABIPrism7000实时定量扩增仪（Appliedbiosystems，USA），流式细胞仪(EPIC-XLBeckmancoulter，USA)、G-CSF，TPO，SCF(Krin，Japan惠赠)，FL(StemCell.Tech.Inc.Canada)，Ficoll淋巴细胞分离液(TBG，天津)，EasySepTMCD34+progenitorseparationkit(StemCell.Tech.Inc.Canada)，6孔培养板（Nunclon，Denmark），StemSpanTM培养液（StemCell.Tech.Inc.C

7、anada）、小鼠IgG1-PE，IgG1-ECD和小鼠抗人CD34-PE，CD45-ECD单克隆抗体(Immunotech，France)。　　CD34+细胞的富集　　8份脐血来自我院足月顺产健康产妇，无菌操作采集，ACD抗凝。脐血加入等量PBS混匀后，缓慢加入Ficoll上，400×g离心30分钟，收集单个核细胞（MNC）后，用EasySepTM磁珠分离出CD34+细胞，液氮冷冻保存备用。　　MSC的培养和照射处理　　MSC的培养方法参照　　体外扩增CBSC的HOXB4表达测定　　为了观察CBPC体外扩增后自我更新水平的变化，我们定量检测了有无BM-MSC为基

8、质的不同培