脐血cd34+细胞体外扩增时hoxb4基因表达的变化论文

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1、脐血CD34+细胞体外扩增时HOXB4基因表达的变化论文.freelRNA水平上检测HOXB4基因的表达，以观察体外扩增脐血CD34+细胞自我更新的水平。结果显示：随着体外培养时间的延长，虽然CD34+细胞数增加.freelemberofhomeoboxgenefamily，iscloselyrelatedtotheself-reneitivehematopoieticstem/progenitorcells(PHSC/PHPC).Thisstudyedtoinvestigatetheself-reneRNAleveleRT-PCR.Ther

2、esultsindicatedthatascultureprolonged，thetotalcells，CD34+cellsgreatlyincreased，hoilartothatofmaturelymphocytes.Meanarroesenchymalstemcells(BM-MSC)couldabatethedeclineofHOXB4expression.Itisconcludedthattheself-renearroesenchymalstemcell；realtimeRT-PCR脐血是造血干细胞(HSC)的重要来源，但脐血量有

3、限，单份脐血HSC往往不能满足成年患者移植的需要。因此，许多人致力于体外扩增脐血造血干/祖细胞(CBSC/CBPC)的研究。既往研究表明，FL、TPO、SCF等可以促使原始造血祖细胞增殖，经2周的培养，CD34+细胞数量增加近百倍［1-3］。我们先前采用骨髓间充质干细胞(BM-MSC)共培养，CD34+细胞比值增加更为明显［4］，但对于体外扩增的CD34+细胞自我更新能力的水平并不清楚。最近发现同源盒基因家族成员HOXB4作为一类转录因子，可正性调节HSC的自我更新［5-7］。HOXB4在原始造血干细胞（PHSC）上高表达，随着PHSC向各系

4、分化，表达水平逐渐降低，直至消失［8］。因此认为：HOXB4表达强弱能够作为一种衡量CD34+细胞自我更新能力的标志。本研究以实时定量RT-PCR的方法检测HOXB4的表达，探讨造血因子刺激的单纯培养及以BM-MSC为基质的体外扩增CD34+细胞能否维持其自我更新的能力。材料和方法主要仪器和试剂TripureReagent(Roche，Germay)，AAN荧光引物探针（Appliedbiosystems，USA），TAQMANPCRuniversalMasterMix（Appliedbiosystems，USA），ABIPrism7000实

5、时定量扩增仪（Appliedbiosystems，USA），流式细胞仪(EPIC-XLBeckmancoulter，USA)、G-CSF，TPO，SCF(Krin，Japan惠赠)，FL(StemCell.Tech.Inc.Canada)，Ficoll淋巴细胞分离液(TBG，天津)，EasySepTMCD34+progenitorseparationkit(StemCell.Tech.Inc.Canada)，6孔培养板（Nunclon，Denmark），StemSpanTM培养液（StemCell.Tech.Inc.Canada）、小鼠IgG

6、1-PE，IgG1-ECD和小鼠抗人CD34-PE，CD45-ECD单克隆抗体(Immunotech，France)。CD34+细胞的富集8份脐血来自我院足月顺产健康产妇，无菌操作采集，ACD抗凝。脐血加入等量PBS混匀后，缓慢加入Ficoll上，400×g离心30分钟，收集单个核细胞（MNC）后，用EasySepTM磁珠分离出CD34+细胞，液氮冷冻保存备用。MSC的培养和照射处理MSC的培养方法参照文献〖9］。选第3或4代的细胞进行15Gy的γ-射线照射，按1×105/孔接种于6孔培养板中，置CO2孵箱过夜，让其充分贴壁，即可与CD34+

7、细胞进行共培养。CD34+细胞的培养在含TPO（100ng/ml）、SCF（100ng/ml）、G-CSF（100ng/ml）、FL（50ng/ml）细胞因子组合的StemSpanTM培养液中，每份CD34+细胞分为两组进行体外扩增培养，一组以BM-MSC为基质，另一组无BM-MSC，将纯化好的CD34+细胞按2×104/孔接种于上述培养液中。然后置于37℃，5%CO2的培养箱培养。当细胞生长密度达到90%时进行分孔传代，分别培养7天和14天，收集各孔悬浮细胞计数。CD34+细胞相对计数应用流式细胞术分析扩增后脐血细胞的细胞表面标志。被测细胞

8、用含1%FBS的PBS缓冲液调节至1×106/ml，加入小鼠抗人CD34-PE和CD45-ECD单克隆抗体在室温下避光孵育20分钟，用流式细胞仪检测。以小鼠IgG1