体外诱导人脐血cd34+细胞向肝细胞的分化

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1、体外诱导人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化作者：张芳婷，叶静，万汇涓，龙霞，聂李平，于洁，房家智【关键词】肝细胞　　摘要：目的探讨在体外培养条件下人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化。方法用磁性细胞分选试剂盒(MACS)分离出CD34+细胞后在含50mL/LFBS，1×ITS，4.7mg/L亚油酸，10-4mol/L2磷酸抗坏血酸的低糖型DMEM中培养，并以FGF4(100μg/L)、HGF(20μg/L)进行诱导。分别于生长因子刺激前和刺激8、16d时留取细胞。通过RTPCR对ALB、AFP、GATA4等mRNA的表达水平进行检测；用免

2、疫细胞化学染色检测ALB蛋白的表达，并收集培养液测定ALB的质量浓度。结果流式细胞仪检测结果显示CD34+细胞的平均分离纯度>90%，达到分离要求。RTPCR检测到诱导后的CD34+细胞表达ALB、AFP、GATA4mRNA。免疫细胞化学染色可见诱导16d的CD34+细胞出现ALB阳性表达细胞，ELISA检测表明诱导组8、16d培养液中的ALB质量浓度明显增高，与诱导前和未诱导组相比均有显著差异(P<0.01)。结论在体外培养条件下，脐血CD34+造血干细胞可分化为表达白蛋白的类肝细胞。　　关键词：脐血CD34+细胞；肝细胞

3、；分化　　ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatethedifferentiationofCD34+cellsderivedfromhumanumbilicalcordbloodintohepatocytecellsinaninvitrosystemsupplementedagiccellsorting(MACS).ThepurityofacquiredcellsinedbyFACSanalysis.PurifiedCD34+cellsentedL/LFBS,1×ITS,10-4mol/Lascorbicacid2

4、phosphate,4.7mg/LlinolEicacid,andabinationofFGF4(100μg/L)andHGF(20μg/L).Culturedcellsinetheextentofthecellconversionbymicroscopicobservationonthemorphology,RTPCRonthetranscriptionofALB,AFPandGATA4mRNA,immunocytochemistryontheexpressionofALBandELISAonthequantificationofth

5、eALBproductinthemedium.ResultsCD34+cellsaccountedformorethan90%afterMACS.ALB,AFPandGATA4mRNAandalbuminprotEInpositivecellsediumhumanumbilicalcordbloodintohepatocyelikecellshadbeenobservedinthisexperimentalculturesystem.　　KEYiltenyi公司)、CD34PE(美国库尔特公司)、淋巴细胞分离液(上海华精生物公司)、低糖

6、型DMEM、FBS(GIBCO公司)、胰蛋白酶(AMRESCO公司)、HGF、FGF4(RD公司)、1×ITS、亚油酸、2磷酸抗坏血酸、青链霉素、台盼蓝(Sigma公司)。RNA提取试剂为MRCGENE公司的TRIZOLREAGENT；一步法RTPCR试剂盒为FINNZYMES产品，50bpmarker为GENERULAR公司产品；人白蛋白(ALB)、人甲胎蛋白(AFP)、GATA4引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，ALB上游引物5′CTTTCAAAGCATGGGCAGTAG3′，下游引物5′GCAGCAGCACGACAGAGTA

7、A3′；GATA4上游引物：ACCTGGGACTTGGAGGATAG，下游引物：GACAAGGACATCTTGGGAAA；AFP上游引物5′TGAGCACTGTTGCAGAGGAG3′，下游引物5′CTGAGACAGCAAGCTGAGGA3′。抗体：抗人ALB单克隆抗体(RD公司)、广谱二抗试剂盒(ZYMED公司)、白蛋白ELISA检测试剂盒(ALPHADIAGNOSTICsanAntonioU.S.A.)。　　1.2方法　　1.2.1CD34+细胞的制备与鉴定健康足月孕妇，待胎儿娩出后自脐静脉无菌采血。先用淋巴细胞分离液初步分离单个核

8、细胞，再用磁性细胞分选试剂盒分离出CD34+细胞。具体步骤为：①用密度梯度离心法分离出脐血MNCs后，用300μLPBS+5g/LBSA重悬；②依次加入100μLFcR受体阻断剂和抗CD34免疫磁珠，混匀后