体外诱导脐血单核细胞分化为破骨样细胞的研究

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1、体外诱导脐血单核细胞分化为破骨样细胞的研究【摘要】　　目的建立人破骨样细胞体外培养的方法，探讨1α,25(OH)2D3、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、前列腺素E2(PGE2)等骨吸收刺激因子对破骨细胞分化、增殖和功能的影响，为进一步研究正畸牙齿移动的生物力学机制奠定基础。方法将脐血单核细胞接种于预置盖玻片和骨片的24孔培养板中，实验组分别加入诱导因子1α，25(OH)2D3、MCSF、PGE2，对照组不加，每3d换液一次，培养7d。采用倒置相差显微镜、TRAP染色等方法观察破骨样细胞的形成情况。结果第3天实验组单核细胞出现融合趋势，第7天TRAP染色可见阳性的多核破骨样细

2、胞，但尚未形成骨吸收陷窝，以1α,25(OH)2D3组破骨样细胞形成数量最多。结论脐血单核细胞经1α,25(OH)2D3、MCSF、PGE2体外诱导培养后可分化为TRAP(+)多核的破骨样细胞，且10-8mol/L的1α，25(OH)2D3具有最强的生物学效应。【关键词】脐血单核细胞；破骨样细胞；细胞培养；1α,25(OH)2D3；MCSF；PGE2　　Differentiationofosteoclastlikecellsinduced　fromumbilicalcordbloodcellsinvitro　　ABSTRACT:ObjectiveToestablisha

3、stableandusefulmethodforculturinghumanosteoclastlikecellsinvitro,andinvestigatetheeffectof1α,25(OH)2D3,MCSFandPGE2onosteoclastsdifferentiation,proliferationandactivationsoastolaythefoundationforfurtherstudyofthebiologicalmechanismfortoothmovement.MethodsTheHCMNCandentineslices.Theexperimentg

4、roupicroscopyandTRAPstainingonocytesbegantofuseandonthe7thdaypositivemultinucleatedcellscouldbeseenedonthedentinslices.Thegroupberofosteoclastlikecells.ConclusionAfterthemonocytesinUCBareculturedby1α,25(OH)2D3,MCSF,PGE2induction,theycanturnintoTRAP(+)multinucleateosteoclastlikecells,the1α,2

5、5(OH)2D310-8mol/LbEingthemosteffective.　　KEYCSF;PGE2　　破骨细胞(osteoclastcells,OC)是具有独特骨吸收功能的多核巨细胞，来源于造血细胞系，OC由单核细胞(mononucleatedcells,MNC)融合而成，不能增殖和传代。破骨样细胞(osteoclastlikecells,OLC)是指实验中原代培养或诱导生成的，具有OC性质，用于细胞学或分子生物学研究的细胞。OLC与OC的不同是前者用于实验研究，而后者位于骨改建部位。体外培养OC，在MNC融合的过程中，受到多种细胞因子以及产生这些细胞因子的细胞及其相关刺

6、激的影响，研究表明：1α,25(OH)2D3、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、前列腺素E2(PGE2)等是OC分化发育的关键因子，可支持血缘性MNC向OC分化。Fujikaa公司)，重组人MCSF(Sigma公司)，PGE2(Sigma公司)，萘酚ASBI磷酸盐(Sigma公司)。　　1.2方法　　1.2.1玻片及骨磨片的处理将1.0cm×1.0cm盖玻片超声清洗后浸入硫酸－重铬酸钾溶液中过夜，高压灭菌后备用。取新鲜牛股骨，制备成0.5cm×0.5cm厚100-200μm的骨片，超声清洗10min×3次，浸入10倍双抗中20min×3次，紫外线照射消毒后存放于-20℃备用。

7、　　1.2.2分离HCMNC取健康产妇抗凝UCB50mL，与PBS等体积混合；将稀释血液以体积比1∶1沿管壁轻轻加于Ficoll液面上，使二者形成一个清晰的界面；2000r/min离心20min，吸取呈云雾状的白膜层(主要含单个核细胞)，收集于离心管内；用PBS洗3次，1000r/min离心5min，弃上清，加入含15%(体积分数)FBS的αMEM培养液重悬计数，调整细胞浓度为1×106/mL。　　1.2.3实验分组和诱导培养HCMNC将收集的HCMNC