人脐血间充质干细胞体外终末分化为神经元样细胞

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1、人脐血间充质干细胞体外终末分化为神经元样细胞【摘要】目的:探讨人脐血间充质干细胞体外培养过程中的终末分化方向。方法:采用密度梯度离心法从人脐血中分离培养间充质干细胞,流式细胞术（FCM）检测细胞表面抗原标记CD29、CD44、CD105、CD34、CD106和HLADR;观察人脐血间充质干细胞在体外培养过程中的增殖情况和形态变化,应用RTPCR和免疫细胞化学方法对P2和P10代人脐血间充质干细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经丝蛋白（NF）的表达情况进行检测。结果:RTPCR分析证实P10代人脐血间充质干细胞有NSE、NF的mRNA表达,免疫细胞化学

2、检测显示P10代细胞能表达NSE和NF,而P2代人脐血间充质干细胞经RTPCR和免疫细胞化学检测均无NSE、NF表达。结论:人脐血间充质干细胞在体外培养过程中能终末分化为神经元样细胞。【关键词】间充质干细胞人脐血分化神经元　　间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)是目前备受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞,最先发现于骨髓,随后在脐血和其他组织中也发现了MSC。研究报道MSC在体外诱导条件下不仅可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞等多种中胚层来源的间质细胞［1］,11而且还能跨胚层横向分化为神经细胞［2］。我们在分离培养

3、人脐血MSC的过程中发现部分脐血MSC在体外培养多次传代的过程中未经诱导表现为类似神经元的形态,因此采用RTPCR和免疫细胞化学的方法对脐血MSC能否表达神经元特异性抗原标记进行检测。　　1材料和方法　　1.1材料淋巴细胞分离液（1.077g/mL）购自中科院天津血液病研究所;DMEMLG培养基购自Sigma公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;青/链霉素、谷氨酰胺、2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/LEDTA购自Gibico公司;鼠抗人CD29FITC、CD44FITC、CD105FITC、CD34FITC、CD106FITC、HLAD

4、RPE单克隆抗体(mAb)及同型对照购自Coulter公司;鼠抗人神经元特异性烯醇化酶（neuronspecificenolase,NSE）和神经丝蛋白（neurofilament,NF）mAb工作液,EliVisionTMPlus试剂盒购自北京中杉生物技术公司。　　1.2方法　　1.2.1PCR扩增引物根据GenBank上登录的NSE、NF基因序列设计,由上海生工生物工程有限公司合成。NSE引物为:5′gaagaaaaggcctgcaactg3′,5′ccaggtcagcaatgaatgtg3′;NF引物为:5′atcggtaaaggtgcactt

5、gg3′,5′11tctacctccccattgacagc3′。扩增片段长度分别为157bp和168bp。　　1.2.2脐血标本的收集脐血来源于南京军区福州总医院妇产科出生的健康足月顺产新生儿。产妇产前检查均正常,脐血的收集均已征得产妇同意。无菌条件下采集脐血:待胎儿娩出后,在距离胎儿5～7cm的脐带处进行双接扎,剪断脐带,穿刺脐静脉后抽取脐血,每份30～80mL,抽取后注入100mL,经无菌处理,加入333.4nkat/mL肝素抗凝的生理盐水瓶中,充分混匀。脐血采集后4h内进行单个核细胞的分离。　　1.2.3脐血单个核细胞的分离采用密度梯度离心法:脐血30

6、～80mL用无菌的DHank’s液等体积稀释。取数个50mL的无菌带盖离心管,先加入1.077g/mL的淋巴细胞分离液25mL,无菌滴管吸取稀释后的脐血25mL,离液面约1cm处缓慢加入,形成一明显的界面。2000r/min离心20min,小心吸取中间的白膜层。加入5倍体积的PBS缓冲液,1000r/min离心10min,洗涤3次,弃上清。所得单个核细胞用于细胞培养。　　1.2.4脐血分离细胞的培养和传代参照骨髓MSC的培养方法［3］从脐血中分离出的单个核细胞以1.0×109/L的密度接种于含体积分数200mL/L胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、1667nka

7、t/mL青/链霉素的DMEMLG培养液中,置于37℃、50mL/L11CO2和饱和湿度的CO2培养箱中培养。5～7d后首次换液,悬浮的细胞被去除,可见瓶底有少量的贴壁细胞。换上新鲜的培养液继续培养。开始每隔5～7d换液1次,待细胞克隆出现、扩大后根据培养液颜色的变化每3～5d换液1次。待细胞克隆不再扩大生长时即开始传代,加入2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/LEDTA消化液,37℃孵育6～8min,200mL/L的胎牛血清终止消化,按1∶3的比例接种至新的培养瓶中继续培养。　　1.2.5脐血分离细胞的表面抗原检测采用流式细胞术（FCM）检测:选择P3代细胞,抗体分

8、别为CD2