脐血间充质干细胞体外分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞的研究

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1、山西医科大学博士学位论文脐血间充质干细胞体外分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞的研究姓名：索利敏申请学位级别：博士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：赵长青20090425份脐血，都分离出不同量的单核细胞，只有3份孕34．37周和l份孕38周的的胎儿脐血得到足量可以传代的梭形细胞，占22％。结论早产胎儿脐血更易得到可以传代和纯化的干细胞，可能与其脐血中间充质干细胞量更多有关。但是足月胎儿脐血也可以获得一定数量纯化和具有增殖分化能力的干细胞。目前各种优化条件还在研究中，尚缺乏统一有效的方法。第二部分鼻黏膜上皮细胞的培养和鉴定目的建立分离细胞培养方案和气液界面培养法培养人鼻黏膜上皮细胞

2、的培养体系。了解不同培养方法对纤毛上皮的影响。方法取全身麻醉下鼾症手术切取的健康下鼻甲黏膜，用含抗(氟康唑、庆大霉素)PBS溶液，在超净台中反复冲洗、浸泡，用O．1％胶原酶Ⅳ消化，分别接种到T25培养瓶进行鼻黏膜上皮分离细胞培养法培养；接种到鼠尾胶原I型包被Transwell支持膜的六孔培养板进行气液界面培养。在倒置相差显微镜下观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，行HE染色和PAS染色、免疫荧光染色、电镜及染色体检查。结果两种方法均成功培养了目的细胞。其中分离细胞培养法得到的细胞形态学上有典型卵石样排列，并夹杂有杯状细胞，抗人角蛋白CK．14阳性，说明其是上皮

3、来源。抗13-Tubulin抗体与抗FOXJl抗体均为阳性。扫描电镜和投射电镜均显示表面含有纤毛，但缺乏极性。P5代染色体检查正常，说明传代细胞可以保证染色体稳定，并进行相关试验。ALL法利用Transwell小室使细胞在模拟在体条件下生长，有助于表面纤毛的分化和颗粒的分泌，并且在形态学和免疫标志方面都得到证实。结论鼻黏膜细胞分离法可以得到纯度较高的鼻黏膜纤毛上皮细胞。ALL法不仅创造了与正常组织相似的微环境，而且应用鼠尾胶原蛋白I型和适合气道上皮培养的支气管上皮培养基，是更适合纤毛分化的培养方法。第三部分脐血间充质干细胞分化为鼻黏膜纤毛上皮的研究目的探讨人脐带血

4、间充质干细胞在气液界面培养，并用鼠尾胶原蛋白I型包被支持膜和支气管上皮专用培养基培养的条件下，诱导分化成纤毛细胞的可能性。方法用rAAv2．EGFP转染人脐带血间充质干细胞，用鼠尾胶原蛋白I型包被支持膜，使用支气管上皮细胞专用培养基，建立气液界面培养。分别于1周和2周后收集细胞，行RT-PCR法检测MUC8基因的表达。UCB．MSCs在膜上细胞生长2周后进行抗13-Tubulin抗体和FOXJl免疫荧光染色。结果转染2小时后可见细胞发出绿色荧光。48小时消化后上流式细胞仪检测，阳性率达97．9％。RT．PCR结果显示，UCB．MSCs不表达MUC8mRNA，鼻黏膜

5、上皮强表达。4山西医科大学博士学付论文随诱导培养时间延长，1周时MUCSmRNA弱表达，培养2周后较前增强，2周时未检测到抗lB-Tubulin抗体的阳性表达，而FOXJl于转染的绿色荧光蛋白背景下可观测到红色荧光阳性表达。在共聚焦显微镜的组合像中可以看到，部分标记绿色荧光的MSCs核内可见红色FOXJl阳性荧光表达。结论UCB．MSCs在气液界面培养，鼠尾胶原蛋白I型包被支持膜，支气管上皮细胞无血清培养基培养，是体外分离、培养和扩增的脐带血间充质干细胞诱导成为表达鼻黏膜纤毛上皮标记的细胞的适宜分化条件。关键词：脐带血，问充质干细胞；鼻黏膜；气液界面；FOXJl；

6、13-Tubulin；MUC8；分化；纤毛细胞5山西医科大学博七学位论文CiliatedCellsofNasalMucusaDifferentiatedfromHumanUmbilicalCordBloodMesenchymalStemCellsAbstractRationale：ManydiseasesCandoharmtonasalmucusa,suchaschronicrhinosinusitis，allergicrhinitis，asthma,cysticfibrosis，endoscopicsurgeryandSOOILRecentstudieshave

7、suggestedthatbothembryonicstemcellsandadultbonemarrowstemcellsCanparticipateinthegenerationandrepairofdiseasedadultorgans，includingthelungs．However，thee)【tentofairwayepithelialremodelingwithadultmarrowstemcellsislow，andtherearenoavailableinvivodatawithembryonicstemcells．Humanumbilical

8、cordb