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时间:2018-11-18
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1、脐血CD34+细胞体外扩增时HOXB4基因表达的变化作者:唐宇宏,费小明,沈文怡,缪扣荣,崔毓桂,汪承亚【摘要】同源盒基因家族成员HOXB4反映原始造血干/祖细胞(PHSC/PHPC)的自我更新和增殖能力。本研究采用实时定量RT-PCR的方法在mRNA水平上检测HOXB4基因的表达,以观察体外扩增脐血CD34+细胞自我更新的水平。结果显示:随着体外培养时间的延长,虽然CD34+细胞数增加,但HOXB4表达下降;周后,HOXB4几乎检测不到,与成熟外周血淋巴细胞表达HOXB4的水平相同;CD34+细胞与骨髓间充质干细胞(BM-MSC)共培养可以减缓CD34+细胞HO
2、XB4表达的下降。结论:脐血CD34+细胞体外扩增过程中自我更新能力逐渐下降。CD34+与BM-MSC共培养有助于减缓体外扩增的CD34+细胞自我更新能力的丧失。【关键词】脐血CD34+细胞 ExpressionofHOXB4inCordBloodProgenitorCellsExpandedinvitro AbstractHOXB4,amemberofhomeoboxgenefamily,iscloselyrelatedtotheself-reneitivehematopoieticstem/progenitorcells(PHSC/PHPC).Thisst
3、udyedtoinvestigatetheself-reneRNAleveleRT-PCR.Theresultsindicatedthatascultureprolonged,thetotalcells,CD34+cellsgreatlyincreased,hoilartothatofmaturelymphocytes.Meanarroesenchymalstemcells(BM-MSC)couldabatethedeclineofHOXB4expression.Itisconcludedthattheself-renearroesenchymalstemcell
4、;realtimeRT-PCR脐血是造血干细胞(HSC)的重要来源,但脐血量有限,单份脐血HSC往往不能满足成年患者移植的需要。因此,许多人致力于体外扩增脐血造血干/祖细胞(CBSC/CBPC)的研究。既往研究表明,FL、TPO、SCF等可以促使原始造血祖细胞增殖,经2周的培养,CD34+细胞数量增加近百倍[1-3]。我们先前采用骨髓间充质干细胞(BM-MSC)共培养,CD34+细胞比值增加更为明显[4],但对于体外扩增的CD34+细胞自我更新能力的水平并不清楚。最近发现同源盒基因家族成员HOXB4作为一类转录因子,可正性调节HSC的自我更新[5-7]。HOXB4
5、在原始造血干细胞(PHSC)上高表达,随着PHSC向各系分化,表达水平逐渐降低,直至消失[8]。因此认为:HOXB4表达强弱能够作为一种衡量CD34+细胞自我更新能力的标志。本研究以实时定量RT-PCR的方法检测HOXB4的表达,探讨造血因子刺激的单纯培养及以BM-MSC为基质的体外扩增CD34+细胞能否维持其自我更新的能力。 材料和方法 主要仪器和试剂 TripureReagent(Roche,Germay),AAN荧光引物探针(Appliedbiosystems,USA),TAQMANPCRuniversalMasterMix(Appliedbiosys
6、tems,USA),ABIPrism7000实时定量扩增仪(Appliedbiosystems,USA),流式细胞仪(EPIC-XLBeckmancoulter,USA)、G-CSF,TPO,SCF(Krin,Japan惠赠),FL(StemCell.Tech.Inc.Canada),Ficoll淋巴细胞分离液(TBG,天津),EasySepTMCD34+progenitorseparationkit(StemCell.Tech.Inc.Canada),6孔培养板(Nunclon,Denmark),StemSpanTM培养液(StemCell.Tech.Inc.C
7、anada)、小鼠IgG1-PE,IgG1-ECD和小鼠抗人CD34-PE,CD45-ECD单克隆抗体(Immunotech,France)。 CD34+细胞的富集 8份脐血来自我院足月顺产健康产妇,无菌操作采集,ACD抗凝。脐血加入等量PBS混匀后,缓慢加入Ficoll上,400×g离心30分钟,收集单个核细胞(MNC)后,用EasySepTM磁珠分离出CD34+细胞,液氮冷冻保存备用。 MSC的培养和照射处理 MSC的培养方法参照 体外扩增CBSC的HOXB4表达测定 为了观察CBPC体外扩增后自我更新水平的变化,我们定量检测了有无BM-MSC为基
8、质的不同培
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