大鼠内皮抑素cdna的克隆与鉴定

大鼠内皮抑素cdna的克隆与鉴定

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时间:2018-11-16

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1、大鼠内皮抑素cDNA的克隆与鉴定作者:杨丽娟,翁绳美,林志雄【摘要】目的获取大鼠内皮抑素的cDNA片断,并构建融合蛋白的原核表达载体。方法以大鼠脑组织总RNA为模板,采用RT-PCR法从中扩增内皮抑素基因,并将获得基因重组入pThiohis表达载体,重组子经双酶切、PCR及测序鉴定。结果从大鼠脑组织中成功扩增内皮抑素的cDNA片断,并将其克隆入pThiohis载体,经双酶切、PCR及测序鉴定,产物大小及基因序列与预期值相符。结论成功构建大鼠内皮抑素基因的重组克隆pThiohis-Endo。【关键词】内皮抑素;基因扩增;克隆,分子;

2、大鼠  内皮抑素是O'REilly等发现的一种内源性血管生成抑制因子[1]。随着对内皮抑素研究的深入,发现其在肿瘤临床诊断、治疗和预后等方面具有广泛应用前景[2]。笔者根据大鼠内皮抑素基因序列,利用RT-PCR方法从大鼠脑组织中扩增内皮抑素的cDNA片断,并将其克隆,为进一步研究和应用奠定基础。  1材料与方法  1.1材料SD大鼠(福建医科大学实验动物中心);TagDNApolymernase、Top10感受态细胞及pThiohisvector、Trizolreagent购自美国Invitrogenlifetechnologie

3、s公司;胰蛋白酶购自美国Sigma公司;One-stepRT-PCRkit购自德国Roche公司;T4DNAligase;kpnI、xbaI购自英国Biolabs公司;DNAMarkerDL2000(大连TaKaRa公司);PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒及小样质粒抽提试剂盒(上海华舜生物工程有限公司),其余试剂均为国产分析纯。  1.2PCR引物据已知的大鼠内皮抑素基因序列(GeneBankaccessionnumber,AF189709),利用计算机PCR引物设计软件VectorNTI6.0设计两对引物,endo1F和end

4、o1R,endo2F和endo2R(含酶切位点,均由上海博亚生物工程公司合成)。  endo1F:5'TTACCCGGGAGTTCCACACC3',endo1R:5'TGTGTCAAAGTTCTGCATCGC3';endo2F:5'GGGGTACCCATACTCACCAGGACTTTC3'(引入KpnI切点),endo2R:5'GCTCTAGACTATTTGGAGAAAGAGGTC3'(引入xbaI切点)。鉴定引物为TrxF和TrxR,TrxF:5'TTCCTC-GACGCTAACCTG3',TrxR:5'TGTAAAACGACG

5、GCCAGTGC3'。  1.3方法  1.3.1取1日龄SD大鼠1只,酒精消毒,迅速取出脑组织,取大脑半球0.5cm×0.5cm×0.5cm脑组织置-80℃中预冷30min后,置入匀浆器研磨粉碎(在碎冰中进行),总RNA的提取按照Trizolreagent总RNA提取法进行,其余脑组织置-80℃冰箱备用。通过甲醛变性电泳和D260nm/D280nm光吸收检测抽取的总RNA的质量和浓度。  1.3.2目的基因内皮抑素cDNA片段获得目的基因分两步获得,首先利用RT-PCR方法,以抽取的大鼠脑组织中RNA为模板,以endo1F及en

6、do1R为引物扩增含内皮抑素开放读码区的长约1kb的片段,反应体系总体积50μL,引物用量15pmol,反应条件:55℃30min→94℃2min→94℃0.5min→55℃0.5min→72℃1min→72℃7min→4℃∞,共30个循环。RT-PCR产物经琼脂糖电泳检测无误后,胶回收纯化(按说明书操作),溶于无菌水30μL备用。取回收的cDNA10ng为模板,以内皮抑素特异性引物endo2F和endo2R为引物,利用PCR方法,获得带有5'及3'端中分别含有kpnI和xbaI酶切位点的目的基因内皮抑素片断,PCR反应体系总体积

7、50μL,引物用量15pmol,反应条件:94℃3min→94℃0.5min→55℃0.5min→72℃1min→72℃7min→4℃∞,共30个循环。PCR产物同样行电泳检测及回收纯化。  1.3.3目的基因与载体的酶切、连接、转化及鉴定经回收纯化的目的基因和载体分别行kpnI和xbaI双酶切,酶切反应体系总体积为20μL(37℃,水育,16h),酶切后产物经胶回收纯化。载体和目的基因经T4DNAligase连接后转化至经CaCl2处理的TOP10感受态细胞,涂布于氨苄青霉素终浓度100μg/mL的等渗LB平板上,37℃培养过夜

8、,次日随机挑克隆,在等渗含氨苄青霉素终浓度100μg/mL的LB溶液7~8mL扩增(37℃,300r/min摇床,10h),取扩增产物2mL按小样质粒抽提试剂盒说明书进行操作,抽提质粒,以所抽取的重组质粒为模板,以TrxF和TrxR为引物行PCR鉴

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