人胎盘trail基因cdna的克隆和鉴定

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1、人胎盘TRAIL基因cDNA的克隆和鉴定【关键词】肿瘤坏死因子;细胞凋亡;配体；RTPCR；序列测定；人胎盘0引言1995年D18T载体、EcoRI,BamHI内切酶、TaqDNA聚合酶、DNAMarkerDL2000购自大连TaKaRa公司，胰蛋白胨（Tryptone），酵母提取物（Yeastextract）购自英国OXOIDLTD公司，质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司，反转录试剂盒购自Fermentas公司，PCR引物由上海博亚生物工程有限公司合成.1.2方法1.2.1引物的

2、设计与合成根据GenBank报道的TRAIL基因的序列并参照已发表的文献设计合成两条引物.上游引物P1序列为:5′GAATTCcggctgcctggctgacttac3′，划线处为EcoRⅠ的酶切位点；下游引物P2序列为:5′GGATCCtttttggttgtggctgctctac3′，划线处为BamHⅠ的酶切位点.1.2.2胎盘组织中总RNA提取采用Trizol一步法提取人胎盘组织中总RNA.称取100mg新鲜人胎盘组织，加入1mLTrizol匀浆，裂解5min.加入氯仿进行液相分离.取上层水相，转至

3、另一离心管中.加异丙醇沉淀，离心10min后弃上清，RNA沉淀于管底.加700mL/L乙醇洗涤，温和震荡离心管，悬浮沉淀.再次离心5min；尽量弃上清；37℃干燥后，溶于DEPC水中.取其中2μL溶液紫外分光光度计定量，其余贮存于-80℃待用.1.2.3RTPCR取5μL总RNA，按Fermentas试剂盒的说明进行操作.扩增参数为：70℃水浴5min，37℃水浴5min，42℃水浴60min，70℃水浴15min，冰浴，待用.然后以cDNA为模板，PCR反应条件为：95℃变性3min后，按94℃30s，55

4、℃30s，72℃1min的顺序循环30次，再于72℃延伸7min.取PCR产物5μL在含溴化乙啶的10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳.1.2.4PCR产物的纯化、克隆与鉴定PCR扩增产物电泳结束后，在紫外检测仪下切取所需大小的凝胶片段，按凝胶回收试剂盒操作说明第一次回收目的片断.将回收产物用EcoRI和BamHⅠ内切酶进行双酶切第二次回收目的凝胶片段，酶切产物在含溴化乙啶的10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，缓冲液为0.5×TBE，电泳结束后，在紫外检测仪下切取目标片段，第三次回收.取凝胶回收纯化的PCR产物4μL加入

5、pMD18T载体1μL,LigationSolutionⅠ5μL,16℃连接过夜.连接产物转化感受态细菌DH5α,然后将连接产物涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基平板中,37℃培养过夜.挑取单菌落加入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基试管中,37℃培养过夜.采用质粒抽提试剂盒进行质粒抽提,对质粒进行EcoRI和BamHI双酶切鉴定,鉴定阳性的载体送大连TAKARA公司测序.将测序证实完全正确的序列命名为pMD18TTRAIL,保存菌种.2结果2.1TRAIL基因的克隆提取胎

6、盘组织总RNA，反转录合成cDNA第一链，以此为模板进行PCR,PCR产物的大小约为1049bp(图1)，无杂带、特异性良好,与我们所设计的相吻合，克隆后片段大小与PCR产物大小吻合.2.2TRAIL基因重组载体的酶切鉴定用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切含有TRAIL基因的pMD18T载体，获得大小为1049bp的目的片段(图2)，表明含有TRAIL基因的克隆载体构建成功.2.3TRAIL基因的序列分析以定向克隆入pMD18T载体中的TRAIL基因的PCR产物转化E.coliDH5α,挑取均含有目的基因片段的

7、5个菌落，取其中1个菌落做序列测定证实，所得序列的结果联网到NCBI进行同源性分析.核酸序列与质粒pMD18TTRAIL中的TRAIL序列同源性为99.69%，发现有两个碱基突变.在NCBI的ORFfinder中，服务器分析开放阅读框架，翻译成281个氨基酸序列，进行同源性分析，同源性为100%.说明测序结果中的两个碱基突变为同义突变，外源TRAIL基因可以正确表达.3讨论TRAIL为肿瘤坏死因子(TNF)超家族的新成员.人的TRAIL基因编码一种Mr32500的II型跨膜蛋白，该蛋白由281个氨基酸残基组

8、成.其氨基端位于胞外区，可形成同源二聚体与相应的膜受体结合，介导信号转导入细胞内，引起细胞凋亡.研究发现，TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡主要通过与其受体结合发挥作用.随着研究的深入,后来相继发现了与TRAIL结合的受体共有5种，它们的功能也渐趋清楚［7-8］.其5种受体为：两种死亡受体即DR4(deathreceptor4)和DR5(deathreceptor5)；两种诱骗受体即DcR1(