玉米小g蛋白基因zmrab6全长cdna克隆、鉴定和的分析

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1、摘要Rab蛋白属于Ras蛋白超家族的小G蛋白(smallG-proteinorsmallGTPase)，分子量大多在22-25kDa之间。Rab蛋白作为真核细胞中各细胞器之间囊泡运输的分子开关，在囊泡运输的不同阶段调节囊泡特定的运输途径。本实验通过对已知的玉米苗期水分胁迫诱导表达eDNA文库进行筛选，获得一个玉米d、GTP结合蛋I!t(smallGTP-bindingprotein，SGP)的相关序列，序列测定后以该eDNA序列为基础进行了电子延伸，根据电子延伸的结果设计引物，利用RT-PCR方法获得了

2、一个玉米(Zeamays)ee尚朱鉴定的eDNA克隆Zmrab6，编码框长62rvp，编码208个氨基酸的蛋白质。它与水稻(Oryzasaava)的GTP-bindingproteinRab6和拟南芥(Arabidops括thaltana)的putativesmallGTP-bindingprotein(序列登录号分别是NP912248．1和AAM65455．1)在蛋白质水平上有着高度同源性(氨基酸序列ID值分别大于98％和94％1，同属d'G蛋白家族的Rab亚族。Sourthem吸印，杂交表明Zmra

3、b6在玉米基因组中可能是以两个拷贝存在，Northern吸印，杂交结果表明干旱、ABA、PEG等逆境都诱导TZmrab缘达量增加。因此认为ZrnrabO矗ff=干旱、ABA等逆境胁迫中起到了某些作用。将Zmrab6基因的编码序列按正确读码框重组到具有六个组氨酸尾(His-Tag)融合标签的pET-30a(+)表达载体中，转化大肠杆菌，获得了稳定表达目标融合蛋白的菌株，．经Ni-NTA琼脂胶柱纯化，获得了纯化的目标融合蛋白。GTP结合试验表明，在原核细胞中表达出的融合蛋白具有体外结合GTP的能力。为了进一

4、步研究该基因的功能，构建了两个表达载体(过量表达、RNAi干扰)并将其分别转化拟南芥。对转基因拟南芥T3、T4代纯合体株系进行表型观察，发现转正义载体的拟南芥明显比野生型拟南芥生长缓慢，其开花、抽苔、结荚分别比野生型晚约5天。关键词：玉米，Rab蛋白，干旱，拟南芥AbstractRabproteinsareafamilyofsmallmolecularweightOTPaseofRassuperfinailywitheharacCedsticmolecularweightabout22-25kD。Rab

5、proteins，behavingaSmolecularswitchesofveaiculartrafickmg,pIayanimportantroleindiferentstepsofvesiculartrafficking．Bymeallsofscreeningamaizeseedlingwatersiress-inducedeDNAlibrary,anESTencodingafragmentofaSGP(smallGTP-bindingprotein)wasobtained．Based011the

6、sequenceofthisEST,theelectronicprolongationwaspa'rormed．According幻theresult．theprimersWeredesignedandaeDNAC[OlleWSSgot,namedZmrabS．Zmrab6contains627bpopenreadingframeandcodes208aminoacidproteins．Atproteinlevel．Zmrab6showshighsimilarityt。theGTP．hindingpro

7、teinR幽6genesfromo

8、’∞aativa(98％)andputativesmallGTP-bindingproteinfromArabidopsisthaliana(94％)，allofwhichbelongtothetab列嘀m娃yof％allOTPbindingprotein．Southernblotmsnlt豳owedthattwoeopysofZrarab6酶presentinmaizegenome．Northerablotanalysesrevealedthattheexpress

9、ionofZmrab6isinducedinmaizeseedingsbydrought．ABAandPEGapplication．TheseobservationamaysuggestthatZrarab6maybeallimportantroleint'esptm$etodrought,saltstressandABA,InordertoinvestigatethefUll(菇OllofZmrab6,twoveeto≈Ⅵ懒constru