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《人胎盘TRAIL基因cDNA的克隆和鉴定.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、人胎盘TRAIL基因cDNA的克隆和鉴定作者：李红梅，宋天保于月成，辛晓燕，张明，许静洪【摘要】目的：利用基因工程技术克隆TRAIL基因全长cDNA,并构建其原核表达载体•方法：从人胎盘中提取总RNA,利用RTPCR技术扩增了TRAIL,将其连接于克隆载体pMD18T中，并通过酶切及测序鉴定载体构建的正确性.结果：应用RTPCR技术和BamHI和EcoRI双酶切成功获得1049bp的目的片段，测序分析结果表明该基因序列与报道的TRAIL基因片段的序列完全相同•结论：成功克隆了TRAIL基因的cDNA全长，为其在肿瘤生物
2、治疗中的应用奠定了基础.【关键词】肿瘤坏死因子；细胞凋亡；配体;RTPCR；序列测定；人胎盘0引言1995年W订ey和Pitt首次从人的表达标签文库中发现一个与肿瘤坏死因子家族基因序列具有高度同源性的DNA克隆，其表达的蛋白具有诱导细胞凋亡的功能，因而将其命名为肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体[1-2].作为一种新的凋亡诱导配体，肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TRAIL)自发现以来，就一直倍受关注•有关TRAIL和TRAIL受体以及其信号转导通路的研究己取得很大进展，而TRAIL特异性诱导肿瘤细胞凋亡的分子调控机制目前尚未
3、阐明•作为一种特异性诱导肿瘤细胞凋亡且无明显毒副作用的分子，TRAIL极有可能成为新的抗肿瘤制剂[3-4]•研究表明，TRAIL在选择性诱导肿瘤细胞凋亡的同时对正常组织没有明显细胞毒性，并且和放、化疗有协同作用，使得TRAIL在肿瘤的治疗上具有广阔的前景[5-6].我们采用RTPCR方法克隆了TRAIL全长的基因片段，经酶切和测序证实其正确性，为进一步研究及临床应用奠定基础.1材料和方法材料大肠杆菌DH5a由第四军医大学西京医院妇产科实验室保存，pMD18T载体、EcoRI,BamHI内切酶、TaqDNA聚合酶、DNA
4、MarkerDL2000购自大连TaKaRa公司，胰蛋白牒，酵母提取物购自英国0X0IDLTD公司，质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司，反转录试剂盒购自Fenneritas公司，PCR引物由上海博亚生物工程有限公司合成.方法引物的设计与合成根据GenBank报道的TRAIL基因的序列并参照已发表的文献设计合成两条引物.上游引物P1序列为：5'GAATTCcggctgcctggctgacttac3',划线处为EcoRI的酶切位点；下游引物P2序列为：5‘GGATCCtttttggttgtggctg
5、ctctac31,划线处为BamHI的酶切位点.胎盘组织中总RNA提取采用Trizol一步法提取人胎盘组织中总RNA.称取lOOmg新鲜人胎盘组织,加入ImLTrizol匀浆，裂解5min.加入氯仿进行液相分离.取上层水相，转至另一离心管中.加异丙醇沉淀，离心lOmin后弃上清，RNA沉淀于管底•加700mL/L乙醇洗涤，温和震荡离心管，悬浮沉淀.再次离心5min；尽量弃上清；37°C干燥后，溶于DEPC水中.取其中2uL溶液紫外分光光度计定量，其余贮存于-8(TC待用.PCR取5uL总RNA,按Fermentas试剂
6、盒的说明进行操作•扩增参数为：70°C水浴5min,37°C水浴5min,42°C水浴60min,70°C水浴15min,冰浴，待用.然后以cDNA为模板，PCR反应条件为：95°C变性3min后，按94°C30s,55°C30s,72°Clmin的顺序循环30次，再于72°C延伸7min.取PCR产物5uL在含漠化乙唳的10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳.产物的纯化、克隆与鉴定PCR扩增产物电泳结束后，在紫外检测仪下切取所需大小的凝胶片段，按凝胶回收试剂盒操作说明第一次回收目的片断•将回收产物用EcoRI和BamHI内切
7、酶进行双酶切第二次回收目的凝胶片段，酶切产物在含漠化乙唳的10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳，缓冲液为XTBE,电泳结束后，在紫外检测仪下切取目标片段，第三次回收.取凝胶回收纯化的PCR产物4uL加入pMD18T载体1uL,LigationSolutionI5yL,16°C连接过夜.连接产物转化感受态细菌D1I5a,然后将连接产物涂布于含100ug/mL氨节青霉素的固体LB培养基平板中，37£培养过夜.挑取单菌落加入5mL含10011g/mL氨节青霉素的液体LB培养基试管中，371培养过夜•采用质粒抽提试剂盒进行质粒抽提，
8、对质粒进行EcoRI和BamHI双酶切鉴定，鉴定阳性的载体送大连TAKARA公司测序.将测序证实完全正确的序列命名为pMD18TTRAIL,保存菌种.2结果基因的克隆提取胎盘组织总RNA,反转录合成cDNA第一链，以此为模板进行PCR.PCR产物的大小约为1049bp（图1）,无杂带、特异性良好，与我们所设计的相吻合，克隆后片段大
