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《临床医学论文-大鼠内皮抑素cDNA的克隆与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、临床医学论文•大鼠内皮抑素cDNA的克隆与鉴定作者：杨丽娟，翁绳美，林志雄【摘要】冃的获取大鼠内皮抑素的cDNA片断，并构建融合蛋口的原核表达载休。方法以大鼠脑组织总RNA为模板，采用RT-PCR法从屮扩增内皮抑索基因,并将获得基因重组入pThiohis表达载体，重组子经双酶切、PCR及测序鉴定。结果从大鼠脑组织屮成功扩增内皮抑素的cDNA片断，并将其克隆入pThiohis载体，经双酶切、PCR及测序鉴定，产物大小及基因序列与预期值和符。结论成功构建大鼠内皮抑素基因的重组克隆pThiohis-EndOo【关键词】内皮抑素;基因扩
2、增;克隆，分子;大鼠内皮抑索是O-Reilly等发现的一•种内源性血管生成抑制因子［1］。随着对内皮抑素研究的深入，发现其在肿瘤临床诊断、治疗和预后等方面具有广泛应用前景［2］。笔者根据大鼠内皮抑素基因序列，利用RT-PCR方法从大鼠脑组织中扩增内皮抑索的cDNA片断，并将其克隆，为进一步研究和应用奠定基础。1材料与方法1.1材料SD大鼠（福建医科大学实验动物中心）;TagDNApolymernase>Top10感受态细胞及pThiohisvector^Trizolreagent购自美国Invitrogen1ifetechnol
3、ogies公司;胰蛋白酶购自美国Sigma公司;One-stepRT-PCRkit购自德国Roche公司;T4DNA1igasc;kpnl>xbal购自英国Biolabs公司；DNAMarkerDL2000（大连TaKaRa公司）；PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒及小样质粒抽捉试剂盒（上海华舜生物工程冇限公司），其余试剂均为国产分析纯。1.2PCR引物据已知的大鼠内皮抑索基因序列（GeneBankaccessionnumber,AF189709）,利用计算机PCR引物设计软件VectorNTI6.0设计两对引物，cndolF和
4、cndolR,cndo2F和cndo2R（含酶切位点,均由上海博亚生物工程公司合成）。cndolF:51TTACCCGGGAG7TCCACACC3r,endolR:5rTGTGTCAAAGTTCTGCATCGC31;endo2F:51GGGGTACCCATACTCACCAGGACTTTC31（引入Kpnl切点）,endo2R:5,GCTCTAGACTATTTGGAGAAAGAGGTC31（引入xbaI切点）。鉴定引物为TrxF和TrxR,TrxF:5'TTCCTC-GACGCTAACCTG3',TrxR:51TGTAAAACGA
5、CGGCCAGTGC3r。1.3方法1.3.1取1FI龄SD大鼠1只，酒精消毒，迅速取出脑组织，取大脑半球0・5cmXO.5cmXO.5cm脑组织置・80°C中预冷30min后，置入匀浆器研磨粉碎（在碎冰小进行），总RNA的提取按照Tnzolreagent总RNA提取法进行，其余脑组织置・80°C冰箱备用。通过甲醛变性电泳和D260nm/D280nm光吸收检测抽取的总RNA的质量和浓度。1.3.2目的基因内皮抑素cDNA片段获得目的基因分两步获得，首先利用RT-PCR方法，以抽取的大鼠脑组织小RNA为模板，以endolF及end
6、olR为引物扩增含内皮抑素开放读码区的长约lkb的片段，反应体系总体积50uL,引物用量15pmol,反应条件:55oC30min->94oC2min->94oC0.5min->55°C0.5min-*72oClmin-72°C7min-4°Coo,共30个循环。RT-PCR产物经琼脂糖电泳检测无误后，胶冋收纯化（按说明书操作），溶于无菌水30uL备用。取冋收的cDNAlOng为模板,以内皮抑素特异性引物endo2F和endo2R为引物，利用PCR方法，获得带有5’及3’端中分别含有kpnl和xbal酶切位点的目的基因内皮抑素片
7、断,PCR反应体系总体积50uL,引物用量15pmoL反应条件:94oC3min~>94oC0.5min~>55°C0.5minf72°Clminf72°C7minf4°C«,共30个循环。PCR产物同样行电泳检测及回收纯化。1.3.3目的基因与载体的酶切、连接、转化及鉴定经回收纯化的目的基因和载体分别行kpnl和xbal双酶切,酶切反应体系总体积为20»L（37°C,水育,16h）,酶切后产物经胶回收纯化。载体和目的基因经T4DNAligase连接后转化金经CaC12处理的TOP10感受态细胞，涂布于氨节青霉素终浓度lOOug
8、/mL的等渗LB平板上，37°C培养过夜，次日随机挑克隆，在等渗含氨节青霉素终浓度100ug/mL的LB溶液7〜8mL扩增（37°C,300r/min摇床，10h）,取扩增产物2mL按小样质粒抽提试剂盒说明书进行操作，抽提质粒，以所抽取的重组质粒为模板，以Trx
