大鼠内皮抑素cdna的克隆与鉴定.doc

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1、大鼠内皮抑素cDNA的克隆与鉴定作者：杨丽娟，翁绳美，林志雄【摘要】目的获取大鼠内皮抑素的cDNA片断，并构建融合蛋白的原核表达载体。方法以大鼠脑组织总RNA为模板，采用RT-PCR法从中扩增内皮抑素基因，并将获得基因重组入pThiohis表迖载体，重组子经双酶切、PCR及测序鉴定。结果从大鼠脑组织中成功扩增内皮抑素的cDNA片断，并将其克隆入pThiohis载体，经双酶切、PCR及测序鉴定，产物大小及基因序列与预期值相符。结论成功构建大鼠内皮抑素基因的重组克隆pThiohis-Endo。【关键词】内皮抑素

2、；基因扩增；克隆，分子;大鼠内皮抑素是O'REilly等发现的一种内源性血管生成抑制因子［1］。随着对内皮抑素研究的深入，发现其在肿瘤临床诊断、治疗和预后等方面具有广泛应用前景［2］。笔者根据大鼠内皮抑素基因序列，利用RT-PCR方法从大鼠脑组织中扩增内皮抑素的cDNA片断，并将其克隆，为进一步研究和应用奠定基础。1材料与方法材料SD大鼠；TagDNApolymernase、Top10感受态细胞及pThiohisvector、Trizolreagent购自美国Invitrogenlifetechnologi

3、es公司；胰蛋白酶购自美国Sigma公司；One-stepRT-PCRkit购自德国Roche公司；T4DNAligase;kpnl、xbal购自英国Biolabs公司；DNAMarkerDL2000；PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒及小样质粒抽提试剂盒，其余试剂均为国产分析纯。PCR引物据已知的大鼠内皮抑素基因序列，利用计算机PCR引物设计软件Vector设计两对引物，endolF和endolR，endo2F和endo2RGGGAGTTCCACACC3r，eTTCTGCATCGC3丨；endoTCACC

4、AGGACTTTC31，eendolF：5rTTACCCndolR:5丨TGTGTCAAAG2F：5fGGGGTACCCATACndo2R:5’GCTCTAGACTATTTGGAGAAAGAGGTC3fo鉴定引物为TrxF和TrxR，TrxF：5fTTCCTC-GACGCTAACCTG31，TrxR：5rTGTAAAACGACGGCCAGTGC3’。方法取1日龄SD大鼠1只，酒精消毒，迅速取出脑组织，取大脑半球XX脑组织置-80°C中预冷30min后，置入匀浆器研磨粉碎，总RNA的提取按照Trizolrea

5、gent总RNA提取法进行，其余脑组织置-80°C冰箱备用。通过甲醛变性电泳和D260nm/D280nm光吸收检测抽取的总RNA的质量和浓度。目的基因内皮抑素cDNA片段获得目的基因分两步获得，首先利用RT-PCR方法，以抽取的大鼠脑组织中RNA为模板，以endolF及endolR为引物扩增含内皮抑素开放读码区的长约lkb的片段，反应体系总体积50uL，引物用量15pmol，反应条件：55°C30min—94°C2min—94°C一55°C—72"Clmin-72°C7min-4°C^,共30个循环。RT-

6、PCR产物经琼脂糖电泳检测无误后，胶回收纯化，溶于无菌水30PL备用。取回收的cDNAlOng为模板，以内皮抑素特异性引物endo2F和endo2R为引物，利用PCR方法，获得带有5'及3'端中分别含有kpnl和xbal酶切位点的目的基因内皮抑素片断，PCR反应体系总体积50PL,引物用量15pmol,反应条件:94°C3min->94°C->55°C-*72°Clmin-*72°C7min-*4°C°°，共30个循环。PCR产物同样行电泳检测及回收纯化。目的基因与载体的酶切、连接、转化及鉴定经回收纯化的目

7、的基因和载体分别行kpnl和xbal双酶切，酶切反应体系总体积为20PL，酶切后产物经胶回收纯化。载体和目的基因经T4DNAligase连接后转化至经CaC12处理的T0P10感受态细胞，涂布于氨苄青霉素终浓度100Pg/mL的等渗LB平板上，37°C培养过夜，次日随机挑克隆，在等渗含氨苄青霉素终浓度100ug/mL的LB溶液7〜8mL扩增，取扩增产物2mL按小样质粒抽提试剂盒说明书进行操作，抽提质粒，以所抽取的重组质粒为模板，以TrxF和TrxR为引物行PCR鉴定，PCR反应条件：94°C3min94°C

8、55°C72°Clmin^72°C7min-*4°C00,共30个循环。所抽取的重组质粒同时也行kpnl和xbal酶切鉴定，条件同上；扩增产物余3〜4mL由上海博亚生物工程公司测序鉴定。2结果目的基因内皮抑素cDNA扩增一步法抽取得到的1日龄大鼠脑组织中RNA通过1%甲醛变性琼脂糖电泳分析，28s和18s两条rRNA条带完整，说明mRNA未发生降解，紫外分光光度计检测，D260nm/D280nm=，D260nm/