大鼠内皮抑素cdna的克隆与鉴定

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1、大鼠内皮抑素cDNA的克隆与鉴定作者：杨丽娟，翁绳美，林志雄【摘要】目的获取大鼠内皮抑素的cDNA片断，并构建融合蛋白的原核表达载体。方法以大鼠脑组织总RNA为模板，采用RT-PCR法从中扩增内皮抑素基因，并将获得基因重组入pThiohis表达载体，重组子经双酶切、PCR及测序鉴定。结果从大鼠脑组织中成功扩增内皮抑素的cDNA片断，并将其克隆入pThiohis载体，经双酶切、PCR及测序鉴定，产物大小及基因序列与预期值相符。结论成功构建大鼠内皮抑素基因的重组克隆pThiohis-Endo。【关键词】内皮抑素;基因扩增;克隆，分子;大鼠　　内皮抑素是O'Reilly等

2、发现的一种内源性血管生成抑制因子［1］。随着对内皮抑素研究的深入，发现其在肿瘤临床诊断、治疗和预后等方面具有广泛应用前景［2］。笔者根据大鼠内皮抑素基因序列，利用RT-PCR方法从大鼠脑组织中扩增内皮抑素的cDNA片断，并将其克隆，为进一步研究和应用奠定基础。　　1材料与方法9　　1.1材料SD大鼠（福建医科大学实验动物中心）;TagDNApolymernase、Top10感受态细胞及pThiohisvector、Trizolreagent购自美国Invitrogenlifetechnologies公司;胰蛋白酶购自美国Sigma公司;One-stepRT-PCRk

3、it购自德国Roche公司;T4DNAligase;kpnI、xbaI购自英国Biolabs公司;DNAMarkerDL2000（大连TaKaRa公司）;PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒及小样质粒抽提试剂盒（上海华舜生物工程有限公司），其余试剂均为国产分析纯。　　1.2PCR引物据已知的大鼠内皮抑素基因序列（GeneBankaccessionnumber，AF189709），利用计算机PCR引物设计软件VectorNTI6.0设计两对引物，endo1F和endo1R，endo2F和endo2R（含酶切位点，均由上海博亚生物工程公司合成）。　　endo1F:5'TT

4、ACCCGGGAGTTCCACACC3'，endo1R:5'TGTGTCAAAGTTCTGCATCGC3';endo2F:5'GGGGTACCCATACTCACCAGGACTTTC3'（引入KpnI切点），endo2R:5'GCTCTAGACTATTTGGAGAAAGAGGTC3'（引入xbaI切点）。鉴定引物为TrxF和TrxR，TrxF:5'TTCCTC-GACGCTAACCTG3'，TrxR:5'TGTAAAACGACGGCCAGTGC3'。　　1.3方法9　　1.3.1取1日龄SD大鼠1只，酒精消毒，迅速取出脑组织，取大脑半球0.5cm×0.5cm×0.5c

5、m脑组织置-80℃中预冷30min后，置入匀浆器研磨粉碎（在碎冰中进行），总RNA的提取按照Trizolreagent总RNA提取法进行，其余脑组织置-80℃冰箱备用。通过甲醛变性电泳和D260nm/D280nm光吸收检测抽取的总RNA的质量和浓度。　　1.3.2目的基因内皮抑素cDNA片段获得目的基因分两步获得，首先利用RT-PCR方法，以抽取的大鼠脑组织中RNA为模板，以endo1F及endo1R为引物扩增含内皮抑素开放读码区的长约1kb的片段，反应体系总体积50μL，引物用量15pmol，反应条件:55℃30min→94℃2min→94℃0.5min→55℃0

6、.5min→72℃1min→72℃7min→4℃∞，共30个循环。RT-PCR产物经琼脂糖电泳检测无误后，胶回收纯化（按说明书操作），溶于无菌水30μL备用。取回收的cDNA10ng为模板，以内皮抑素特异性引物endo2F和endo2R为引物，利用PCR方法，获得带有5'及3'端中分别含有kpnI和xbaI酶切位点的目的基因内皮抑素片断，PCR反应体系总体积50μL，引物用量15pmol，反应条件:94℃3min→94℃0.5min→55℃0.5min→72℃1min→72℃7min→4℃∞，共30个循环。PCR产物同样行电泳检测及回收纯化。　　1.3.3目的基因与

7、载体的酶切、连接、转化及鉴定经回收纯化的目的基因和载体分别行kpnI和xbaI双酶切，酶切反应体系总体积为20μL（37℃9，水育，16h），酶切后产物经胶回收纯化。载体和目的基因经T4DNAligase连接后转化至经CaCl2处理的TOP10感受态细胞，涂布于氨苄青霉素终浓度100μg/mL的等渗LB平板上，37℃培养过夜，次日随机挑克隆，在等渗含氨苄青霉素终浓度100μg/mL的LB溶液7～8mL扩增（37℃，300r/min摇床，10h），取扩增产物2mL按小样质粒抽提试剂盒说明书进行操作，抽提质粒，以所抽取的重组质粒为模板，以TrxF和TrxR为引物行P