rhoa在洛伐他汀抑制hepg2细胞增殖中的作用

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1、RhoA在洛伐他汀抑制HepG2细胞增殖中的作用作者：吴宝安，梁力建，李威，宋香茹【关键词】羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂；HepG2细胞；增殖；RhoA［摘要］目的：探讨RhoA在洛伐他汀抑制HepG2细胞增殖过程中所起的作用。方法：用基因芯片、RT_PCR和ethods:ThecDNAmicroarrayassay,RT_PCRandG_CoA)还原酶抑制剂通称他汀类药物(statins)，广泛用于高脂血症的治疗。近年来statins的抗肿瘤作用日益受到重视。洛伐他汀有诱导头颈部鳞癌、甲状腺癌细胞凋亡的作用［1，2］。口服普伐他汀能延长晚期肝细胞癌患者中位生

2、存期［3］。我们发现，洛伐他汀对人肝癌细胞系HepG2细胞的增殖有抑制作用。RhoA(Ras相似物成员A，Rashomologgenefamily，memberA)属Rho家族蛋白的Rho亚家族成员，可通过多种信号途径参与调节细胞的生长、凋亡和细胞周期［4］。本研究旨在探讨RhoA在洛伐他汀抑制HepG2细胞增殖过程中的作用。　　1材料与方法　　11主要试剂、仪器　　HepG2细胞系由中山大学附属第一医院外科实验室保存。洛伐他汀、香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)和法呢基焦磷酸(FPP)购自美国ALEXIS公司；DMEM培养基(GibcoBRL公司，美国)；胎牛血清

3、（杭州四季青公司，中国）；TRIzol、SuperScriptTMⅡRNaseH-ReverseTranscriptase(Invitrogen公司，美国)；RNeasyKit、QIAquickNucleotideRemovalKit(QIAGEN公司，德国)；Cy5、Cy3（Amersham公司，英国）；5K基因表达谱cDNA芯片(上海生物芯片公司，中国)；ReverTraAce_α_TM(TOYOBO公司，日本)；鼠抗人RhoA抗体(SantaCruz公司，美国，南方医院李湘博士惠赠)；鼠抗人β_actin（武汉博士德公司，中国）；ECL化学发光液（PIRE

4、CE公司，美国）。DU800核酸/蛋白分析仪（BECKMAN公司，美国）；PCR仪(AppliedBiosystems公司，新加坡)；酶标仪，UVP杂交炉（Thermo公司，美国）；扫描仪(Agilent公司，美国)；凝胶成像分析系统，SYnGENE化学发光、荧光检测数字成像系统(Synoptics公司，英国)；PO组合式电泳系统(Bio_Rad公司，美国)。　　12方法　　121细胞培养　　洛伐他汀的活化参照Jakobisiak等［5］的方法稍加改进。HepG2细胞在含体积分数10%胎牛血清的DMEM，37℃，体积分数5%　CO2，饱和湿度贴壁培养，70%融合

5、时换用无血清DMEM，24h后再换成含体积分数10%胎牛血清的DMEM，并加入相应药物。　　122平板克隆形成试验制备细胞悬液，按每皿500个细胞的密度接种于100mm培养皿培养2周后用甲醇固定，姬姆萨液染色，光镜下观察。　　123总RNA提取　　实验组细胞加入洛伐他汀(20μmol/L)，对照组加等量溶剂。18h后每5×106个细胞加入1mLTRIzol，提取总RNA，用RNea_syKit纯化总RNA，核酸/蛋白分析仪检测浓度。样品置于_80℃冰箱中，待作基因芯片和RT_PCR检测。　　124基因芯片检测cDNA芯片包含有关细胞分化、信号传导、结构、成分、基

6、因和蛋白表达、代谢、假基因等已知功能或者与疾病相关的人类基因5075个，设10个阳性对照和6个阴性对照。采用cDNA直接标记法标记RNA探针，其中实验组以Cy3荧光标记，对照组以Cy5荧光标记，纯化探针。各取30pmol标记后探针42℃与芯片避光杂交16h，然后用1×SSC/质量分数02%SDS(55℃)、01×SSC/02%SDS(55℃)、01×SSC溶液(室温)依次洗片。芯片结果经扫描后读取数据并进行标准化分析，Cy3/Cy5为实验组/对照组的ratio值，差异基因筛选标准是ratio=2为上调基因，ratio=05为下调基因。　　125RT_PCR检测从

7、两组取等量RNA各1份，用ReverTraAce_α_TM合成cDNA。根据基因芯片结果，参照GenBank序列，设计引物(primer50软件)由Invitrogen公司合成。RhoA：上游序列5′_CTGGACTCGGATTCGTTG_3′，下游序列5′_TTGGGACAGAAATGCTTGAC_3′；内参照引物：β_actin：上游序列5′_CTGTCTGGCACCACCAT_3′，下游序列5′_GCAACTAAGTCATACTCCGC_3′。PCR反应条件：94℃30s，55℃30s，72℃45s，29个循环后72℃7min。扩增产物分别长352bp和2

8、54bp，经质量分数20