复方木鸡冲剂抑制hepg2细胞增殖及诱导分化的作用论文

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1、复方木鸡冲剂抑制HepG2细胞增殖及诱导分化的作用论文【摘要】目的：探究复方木鸡冲剂在体外对人肝癌细胞株HepG2的抗增殖作用及其机制。方法：光镜观察细胞形态的变化。MTT法检测木鸡冲剂对肿瘤细胞增殖的抑制作用。流式细胞仪分析细胞凋亡的情况。全自动生化分析仪检测培养上清液中GGT、ALP浓度的变化；免疫细胞化学法检测细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子P21ujiChongjionhepatocarcinomacelllineHepG2.MethodsMTTassayacells.ApoptosisinducedbyMujiChongjiicroscopyandfloetry(FCM),Thec

2、ontentsofγ-glutamyltranspeptidase(γ-GT)andalkalinephosphatase(ALP)inthesupernatantinedbybiochemistrytechniques,α-fetoprotein(AFP)munoassay.Immunohistochemicalstainingedtodeterminetheproteinofp21EM培养液制备成浓度为1×105/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100ul。实验设空白对照组，阳性药物对照组（β-榄香烯）及木鸡冲剂组，每组设4个平行孔,于37℃，5%CO2条件下分别培养24h、

3、48h、72h后，每孔加15ulMTT液，避光继续培养4h后离心，弃上清，加DMSO150ul/孔，在自动酶标仪上以570nm波长测定各孔OD值，计算药物对肿瘤细胞的生长抑制率:抑制率=(1-实验组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100%2.2细胞形态学观察取复方木鸡冲剂作用24h、48h和72h后的HepG2细胞涂片，自然凉干，瑞氏-姬姆萨染色，显微镜下观察细胞的形态，常规培养细胞作空白对照。2.3流式细胞仪(AnnexinV/PI双染法)检测收集经复方木鸡冲剂处理24h和72h的HepG2细胞（1～5×106），预冷PBS液洗两遍，吸取250ul的1×BindingBuffer和2

4、50ul灭菌去离子水,混匀,用上述500ul的1×BindingBuffer悬浮细胞,加入1ulAnnexinV-EGFP,混匀后加入5ulPI，混匀，室温下避光反应15min后上机检测凋亡发生情况。2.4全自动生化分析仪检测GGT、ALP收集药物作用48h的HepG2细胞，经全自动生化分析仪检测GGT、ALP含量，与常规培养细胞的上清液比较，实验重复三次，计算平均值。2.5HepG2细胞AFP分泌量的测定收集药物作用48h后的HepG2细胞，用放射免疫测定法检测AFP的含量，常规培养HepG2细胞上清液的AFP含量为对照，实验重复三次，计算平均值。2.6免疫细胞化学方法检测细胞周期依赖性

5、蛋白激酶抑制因子P21TT法观察药物作用不同时间后，对HepG2细胞增殖的影响，确定生长受到明显抑制的药物起效时间。实验结果显示，复方木鸡冲剂对HepG2细胞的增殖有明显的抑制作用，但未显示出时间依赖性。在作用24h时基本上达到高峰处于稳定状态。经细胞凋亡检测证实，复方木鸡冲剂对HepG2细胞增殖的抑制作用与诱导细胞凋亡有关。AnnexinV+/PI-双染法是检测细胞凋亡早期变化和晚期改变的方法之一。Annexin-V可以与早期凋亡时翻转到细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合4，PI（碘化丙啶）在细胞凋亡晚期透过细胞膜而使细胞核染成红色。AnnexinV-FITC与PI联合使用，就可

6、以将早期凋亡细胞(AnnexinV+/PI-)和晚期凋亡细胞以及坏死细胞(AnnexinV+/PI+)区分开来5。实验结果表明，复方木鸡冲剂作用HepG2细胞24h后早期凋亡率和晚期凋亡率相当；药物作用72h后，主要表现为晚期凋亡和坏死，这一结果提示，复方木鸡冲剂诱导细胞凋亡的过程比较慢。坏死细胞百分比的增加是由于培养体系中没有吞噬细胞，凋亡的细胞最终发生了崩解。进一步的深入研究发现，复方木鸡冲剂对HepG2细胞增殖的抑制作用还与诱导细胞分化有关。恶性肿瘤细胞在形态、功能等方面都类似于未分化的胚胎细胞，大多数学者认为失控的增殖是许多恶性肿瘤的基本特征，而肿瘤细胞诱导分化治疗是肿瘤治疗研究的

7、新途径，其基本特点在于不单是杀伤肿瘤细胞而是诱导细胞分化为正常或接近正常细胞6。细胞形态是客观反映细胞分化情况的指标之一。复方木鸡冲剂处理后的HepG2细胞，由多角形转变为长梭形或树枝状，有突起伸出。细胞体积明显缩小，细胞核变小，固缩而深染，染色质凝集，核仁数目变少，肾形核多见，核浆比例降低，细胞分裂相减少，提示细胞开始恢复分化。另一方面能反映肝细胞分化的酶和蛋白7的测定结果显示，经复方木鸡冲剂处理后HepG2细胞分泌肝