自体骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨基质修复软骨缺损的前期研究

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1、广西医科大学硕士学位论文自体骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨基质修复软骨缺损的前期研究姓名：许圣荣申请学位级别：硕士专业：创伤骨科手外科指导教师：赵劲民20080301广西医科大学研究生学位论文独创性声明．秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切责任

2、。论文作者签名：指导教师签名：日期：萨"彦一，6一加广西医科大学保护知识产权说明本人完全了解广西医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间，博士后工作人员、人才小高地工作人员在校工作期间，论文工作的知识产权单位属广西医科大学。本人保证在校期间和离校后，发表或使用论文工作成果时署名第一作者单位均为广西医科大学。学校有权保留论文，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。．论文作者签名：孑年匆謦指导教师签名_猁找、日期：灿毋一15I，加自体骨髓问充质干细胞复合同种异体脱钙骨基质修复软骨缺损的前期研究自体骨髓间充质

3、干细胞复合同种异体脱钙骨基质修复软骨缺损的前期研究摘要目的：体外培养兔自体骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchylnalstemcells，BMSCs)并向软骨细胞分化，探讨其与兔同种异体脱钙骨基质(decalcifiedbonematrix，DBM)体外相结合培养的可行性，为下一步将细胞支架复合物植入兔膝关节软骨缺损处修复关节软骨缺损做准备。方法：抽取兔骨髓液，分离纯化骨髓液中的间充质干细胞。取扩增传代至第3代的BMSCs分成实验组和对照组，实验组用10％胎牛血清的LG—DMEM培养液加入转化生长因子一B。(transforminggrowthfactor—Bl

4、，TGF—B1)和地塞米松联合诱导，对照组用10％胎牛血清的LG—DMEM培养液自然分化。在诱导4天、7天、14天后，分别用甲苯胺蓝染色检测细胞蛋白多糖的表达，II型胶原免疫组化染色检测细胞II型胶原的表达并计算阳性率。制备兔DBM，采用液体置换法检测经脱钙2天、3天、4天支架材料的孔隙率。扫描电镜观察DBM的超微结构，以及细胞与DBM体外结合培养3天的粘附情况。结果：BMSCs取材方便，体外培养生长稳定，细胞活性好。实验组BMSCs向软骨细胞分化，细胞甲苯胺蓝染色异染，II型胶原免疫组化染色阳性率与对照组相比有显著性差异。脱钙3天的DBM多孔结构及空隙适合细胞的粘附和增殖。细胞

5、和DBM体外培养粘附良好。结论：兔自体BMSCs取材方便，细胞活性好，经体外诱导后可以向软骨细胞分化。兔同种异体DBM制备方便，具有良好的生物学特性，两者体外结合培养粘附良好，可以为进一步体内实验做好准备。关键词：骨髓间充质干细胞，诱导，软骨细胞，脱钙骨基质自体骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨基质修复软骨缺损的前期研究的种子细胞。研究表明将种子细胞直接植入软骨缺损部位，会流失至关节腔，局部不会形成软骨组织H1。如果先将种子细胞附着到支架载体上再植入，可以形成新的软骨。因此，合适的载体在修复软骨缺损中起重要的作用。DBM具有良好细胞组织相容性。其次具有适应的生物降解性，材料的降解

6、速率与植入的细胞组织再生速率相匹配。另外其天然孔隙结构，为种子细胞的均匀分布和生长提供足够的空间。最后具有可塑性和一定的机械强度，使材料在手术植入时和植入体内的一定时间内保持所需的外形和力学特性，从而使再生组织得以最大限度地过渡到生理状态。因此可以认为它是一种较好的软骨组织工程支架材料。本实验应用兔自体BMSCs经特定培养向软骨细胞诱导分化后，复合兔同种异体DBM体外培养，电镜观察两者结合情况，为进一步将细胞支架复合物植入兔膝关节软骨缺损处修复关节软骨缺损做好准备。自体骨髓问充质干细胞复合同种异体脱钙骨基质修复软骨缺损的前期研究2∞5级硕士研究生学位论文取第卜5代传代细胞，待铺满

7、瓶底后制备单个细胞悬液，浓度1×105／m1，O．4％台盼蓝作为染色剂，细胞悬液和染色剂比例为1：1混合，3min后用血细胞计数板计数细胞(包括活细胞和死细胞)，共3次，取3次平均值。根据公式求活细胞率：活细胞率=活细胞数／(活细胞数+死细胞数)×100％。2．4BMSCs向软骨细胞的诱导分化：选择16只兔子的第3代BMSCs(随机分成2组，每只兔的BMSCs接种3孔，分别诱导4d、7d、14d)胰酶消化法制各成单细胞悬液，以1×105／m1的接种密度接种于12孔板内(内置玻片)