同种异体间充质干细胞复合纤维蛋白修复骨缺损

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1、同种异体间充质干细胞复合纤维蛋白修复骨缺损作者：窦强兵，孔荣，朱六龙，戴永立，沈勇【关键词】松质骨缺损　　摘要：　　［目的］探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)的体外培养，以及同种异体MSCs复合纤维蛋白修复兔股骨髁松质骨缺损的效果。［方法］在日本大耳兔双侧股骨髁制作06cm×10cm松质骨缺损，左侧植入同种异体MSCs纤维蛋白复合物，右侧单纯植入纤维蛋白。分别于术后2、5、8周行放射学、组织学检查，以了解骨缺损修复情况。［结果］单纯植入纤维蛋白的一侧不能自行愈合。植入复合物的一侧术后2周可见少量骨组织生成，5周可见大量

2、模糊骨痂，术后8周骨缺损基本愈合。除少量炎性细胞浸润外，各期均未见明显免疫排斥反应。［结论］同种异体MSCs复合纤维蛋白可有效修复兔股骨髁松质骨缺损，8周内机体的免疫排斥反应较弱。　　关键词：松质骨缺损；间充质干细胞；纤维蛋白；同种异体　　Abstract：［Objective］Todiscussbonemarroesenchymalstemcells(MSCs)cultureinvitroandthecurativeeffectofrepairingcancellousbonedefectsinrabbitsrabbitbonemarrourcondyla

3、rin15Japanesebigearrabbits,theleftbonedefectsinedradiologicallyandhistoloyicallyatthe2nd,5th,8thplantationcouldn'thealspontaneouslyandnoboneformationepoint.Inthedefectsplantation,thereationmuneresponeexceptafematorycellsinfiltrate.［Conclusion］ThepoundgraftsofallogenicMSCsandfibrins

4、homunogenicityethodforrepairingcancellousbonedefects.　　Keyalstemcells(MSCs);Fibrin;Allogenic　　骨缺损常发生于创伤、感染、肿瘤切除等疾病，是骨科常见难题，在治疗上近年兴起的以间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)为种子细胞的组织工程骨修复具有广阔的临床应用前景。本实验采用同种异体MSCs与纤维蛋白复合物修复兔股骨髁骨缺损，观察异体MSCs在体内的成骨及免疫情况，为临床使用同种异体MSCs提供实验依据。　　1材料和方法　　11MSCs的分离培

5、养　　4个月龄青紫蓝兔1只，重20kg，用含肝素30u／ml的注射器于股骨粗隆抽取骨髓2ml，加入含10％胎牛血清和青霉素及链霉素的DMEM培养基(Gibsco公司)中吹打混匀，置培养瓶中，37℃、5％C02、95％相对湿度的孵育箱内培养。5d后半量换液，1周后全部换液，以后每周换液2次，逐步去除未贴壁细胞。14d后贴壁细胞汇合到90％生长面积时，用025％的胰蛋白酶消化，按1∶2传代，取第2代MSCs备用。　　12MSCs纤维蛋白复合物的制备　　取第2代细胞计数后制成50×106／ml的细胞悬液，按1∶1与纤维蛋白(医用安可胶)混合，置12孔培养板，37℃

6、孵育箱内聚合1h，收缩过夜后备用。　　13骨缺损模型的制作及处理　　选用4～5个月龄日本大耳兔15只(安徽医科大学动物中心提供，清洁级)，重20～25kg，雌雄不限。3％戊巴比妥30mg／kg耳缘静脉麻醉，取膝关节外侧切口显露股骨髁，用手钻在股骨髁外侧宽大处制作06cm×10cm的松质骨缺损。将骨屑冲洗干净后，左侧植入同种异体MSCs纤维蛋白复合物，右侧单纯植入纤维蛋白。术后不固定肢体，分笼饲养，连续3d使用青霉素预防感染。　　14术后观察　　观察动物的进食、活动和切口愈合情况。分别于术后2、5、8周摄双膝关节侧位片，以了解骨缺损的修复。各期用空气栓塞法处死

7、动物5只，大体观察缺损区修复情况，切取股骨髁骨标本，用10％中性福尔马林固定，脱钙切片后HE染色，光镜下观察新生骨痂和骨缺损愈合情况。　　2结果　　21MSCs培养情况　　培养的原代细胞混有大量红细胞，呈圆形、椭圆形或梭形，生长较慢。传代后细胞变纯，生长加快，呈集落样螺旋状生长，成纤维细胞形态。　　22实验动物情况　　术后3～4h麻醉清醒后基本可站立，前3d活动、进食减少，以后逐渐恢复正常。切口无感染，其中1例取标本时发现关节腔感染。　　23放射学检查结果　　植入同种异体MSCs纤维蛋白复合物的左侧，术后2周可见少量骨痂(图1)，5周可见大量模糊骨痂影(图2

8、)，8周缺损区基本消失，为密度增高的骨痂影充填(图3