幽门螺杆菌cagpai hp0523基因的克隆及功能预测

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1、幽门螺杆菌CagPAIhp0523基因的克隆及功能预测：邵世和钟桥黄世腾韩军黄河田树伟【摘要】目的：明确幽门螺杆菌CagPAIhp0523基因的功能，探讨其在幽门螺杆菌致病中的作用。方法：设计引物，以幽门螺杆菌NCTC11637为模板，采用聚合酶链反应（PCR）扩增获得目的片段；将其进行TA克隆后，进行测序。将该基因序列与其他菌株做BLAST比对分析，并结合生物信息学数据库和软件，分析其序列特征和理化特性。结果：经酶切，测序分析表明，插入的基因片断为510bp，与基因库公布的幽门螺杆菌26695及J99序列相比较，同源性高达94%；软件预测其编码的蛋白为

2、169个氨基酸，其相对分子质量约为19.7kDa，等电点约为9.53；基序分析表明，在33～165位氨基酸之间存在一个保守的SLT催化基序，可能是溶菌糖基转移酶；对其催化能力进行预测，结果表明，HP0523（33.7%）催化能力可能较T4溶菌酶（32.3%）和溶菌酶SLT70（28.6%）的活性高。结论：成功克隆了幽门螺杆菌CagPAI的hp0523基因，对其序列进行了深入分析，为进一步研究其功能，阐明幽门螺杆菌CagPAI的致病机制奠定了基础。【关键词】幽门螺杆菌；Cag致病岛；功能预测；溶菌糖基转移酶［Abstract］Objective:Toanal

3、yzethefunctionandtheroleofhp0523geneinHelicobacterpylori(H.pylori)CagPAIforpathogenicity;Methods：Polymerasechainreaction(PCR)plifythehp0523genefromH.pyloriNCTC11637,andthenclonedintothepGEMTeasyplasmidandsequenced.Usethebioinformationdatabasesandtoolstoanalyzetheinformationandpr

4、opertiesofthetargetsequence.Results：SequenceanalysissuggeststhatthisfragmentolecularatelyinH.pyloristrains26695andJ99.Motifanalysissuggeststhatitmaybelytictransglycosylase,ainbetthegeneralacidbasecatalysispotentialsuggestthatHP0523(33.7%)e(32.3%)andSLT70(28.6%).Conclusion：Thehp0523

5、geneH.pyloriNCTC11637successfully,andprovideasolidbasefortheresearchonthepathogenicitymechanismofH.pyloriCagPAI.［Keyega公司）；绵羊血（杭州天和生物公司）；胶回收试剂盒（上海捷瑞生物公司）。1.1.3主要仪器核酸紫外检测仪（EppendorfBiophotometer）；PCR仪（Eppendorf）；凝胶成像系统（Genius）。1.2方法1.2.1幽门螺杆菌的培养与鉴定将H.pyloriNCTC11637接种于含10％羊血的哥伦比亚平板上

6、，微需氧培养72h。从固体培养基上刮取生长状态良好的H.pylori菌落,移入1.5mlEppendorf管，用适量PBS缓冲液洗涤沉淀物2～3次，离心收集细菌。基因组DNA提取参照《分子克隆》酚氯仿提取DNA法的步骤进行。1.2.2PCR扩增根据hp0523基因的全长序列，设计上、下游引物:P1:5′CGGGAATTCTTGTTTGGGAAATGGAT3′；P2:5′ATTCTCGAGCTACTCGTTATATCGCACTT3′，在其5′端分别引入EcoRI，XhoI酶切位点，PCR产物长度为510bp。引物由上海生工生物技术有限公司合成。以H.py

7、loriNCTC11637菌株基因组DNA为模板，用ExTaq聚合酶进行PCR扩增（25μl反应体系）。扩增参数为：94°C5min，94°C30s，52°C30s，72°C1min，30个循环，72°C10min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，Genius凝胶电泳图像分析系统分析鉴定并用胶回收试剂盒回收PCR产物。1.2.3TA克隆与测序分析胶回收的PCR产物与pGEMT载体，加1μlT4DNA连接酶，4°C连接过夜。连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞。转化后的细菌涂布于含50μg/ml氨苄西林的LB平板上，37°C培养16h。挑

8、取菌落转种于含氨苄西林50μg/ml的