幽门螺杆菌cag致病岛hp0520基因功能的研究

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1、啦圆嘲博士学位．。论文DoCToRALDISSERTATION论文题目：学科专业：作者姓名；指导教9雨：答辩日期：圃坐：3堡墅扭蛰幽丛盘垒纽!￡丝差因边照!i叠整：!l量匪礁丝豸逝竖．一至＆盘勋妒和勉趣迎[主聋!兰目分类号UDC密级坌五编号f丝12垦丛!竺盘博士学位论文幽门螺杆菌cag致病岛hp0520基因功能的研究指导教师：邵世和作者姓名：王晓春申请学位：医学博士专业名称：临床检验诊断学论文提交日期：2013年儿月论文答辩日期：2013年12月学位授予单位和日期：2013年12月答辩委员会主席：评阅人：ClassifiedInde

2、x：R378．99UDC：579Ph．D．DissertationCHARACTERIZATIONOF酊2口GENEINTHECIAGPATHOGENICITYISL删DOFHE!LK泐酗C姗PlZ()脚ByWangXiaochunMajor：ClinicalLaboratoryDiagnosticsSupervisor：ProfiShaoShiheNovember，2013独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表

3、或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：土骇培勘B年l-月猸学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全

4、文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不保密回。学位论文作者签名：王瓯南圳1≥年I)-月g-日指导教师签名：聊辞≯f3年l歹与蒯摘要目的：幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hpylori)为人类胃部疾病的重要致病菌之一，世界范围内感染率达到50％。I型Hpylori菌株因携带cag致病I岛(cagpathogenicityisland，cag．PAl)而致其毒性较强

5、，流行病学研究显示：I型菌株与多种胃肠道疾病的发生关系更为密切。cag致病岛编码的Iv型分泌系统能够合成并转运一细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxin—associatedgeneA，CagA)：i抛lJ宿主细胞内导致细胞功能紊乱。目前已知致病岛可编码27种蛋白，但多数蛋白的功能尚未十分清楚。本童选择了致病岛中的hp0520作为研究对象，通过微生物学、分子生物学、免疫学和生物信息学等技术探讨hp0520基因的功能，为深入研究cag致病岛的功能和致病机制奠定基础。方法：1．根据Genbank收录的Hpy／or／26695全基因序列

6、，利用PrimerPremier6．0设计hp0520全长克隆基因引物，通过T-A克隆的方法，获得目的基因片段并测序；并对序列进行生物信息学分析研究。2．构建原核表达载体pET-32a-hp0520，并转化入表达工程菌Rosetta(DE3)；经IPTG诱导后，使用QIAGEN系统Ni2+_NTA柱纯化获得融合蛋白。经SDS．PAGE电泳、Westernblot分析和质谱方法鉴定目的蛋白。3．纯化后的HP0520融合蛋白免疫BALB／c小鼠，利用细胞融合技术将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2加)融合获得杂交瘤细胞；通过数轮亚

7、克隆和间接ELISA筛选能稳定分泌单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)的杂交瘤细胞；腹腔接种阳性杂交瘤细胞于BAIB／c小鼠，制备腹水型mAb，并进行纯化：用ELISA法鉴定mAb的免疫球蛋白类型；间接ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清、腹水的抗体效价；间接ELISA法和Westernblot法鉴定mAb与抗原的反应特异性。4．利用同源重组原理，构建hp0520基因缺陷自杀质粒pBlueKM40一Ahp0520：：Kmr，电转化进入HpyloriNCTCll637中，通过抗性筛选和PCR及Western—blo

8、t方法验证，获得hp0520基因缺失株。江苏大学博士学位论文：幽门螺杆菌cag致病岛hp0520基因功能的研究5．收集并裂解HpyloriNCTCll637细菌菌体，使用超高速低温离心方法得到不同的亚细胞组分：膜组分(包括内膜和外膜)